Характеристика антигенных препаратов, выделенных из вакцинных штаммов Staphylococcus aureus, культивируемых в различных условиях




Скачать 437.52 Kb.
НазваниеХарактеристика антигенных препаратов, выделенных из вакцинных штаммов Staphylococcus aureus, культивируемых в различных условиях
страница1/3
ИГНАТОВА Ольга Михайловна
Дата конвертации12.12.2012
Размер437.52 Kb.
ТипАвтореферат
  1   2   3


На правах рукописи

ИГНАТОВА

Ольга Михайловна

Характеристика антигенных препаратов, выделенных из вакцинных штаммов Staphylococcus aureus, культивируемых в различных условиях

03.02.03 – микробиология

14.03.39– клиническая иммунология, аллергология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Москва – 2010


Работа выполнена в Научно-исследовательском институте вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова РАМН


Научные руководители: доктор медицинских наук,

профессор Ирина Мироновна Грубер

доктор медицинских наук

Нэлли Кимовна Ахматова
Официальные оппоненты: доктор медицинских наук,

профессор Алла Петровна Батуро

доктор медицинских наук,

профессор Олег Витальевич Калюжин
Ведущая организация: Первый Московский Государственный медицинский университет имени И.М.Сеченова

Защита диссертации состоится «23» декабря 2010 г. в 12 часов на заседании диссертационного совета Д 001.035.01 при НИИВС им. И.И. Мечникова РАМН по адресу: 105064, Москва, Малый Казённый пер., д.5а.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИВС им. И.И. Мечникова РАМН.
Автореферат разослан «19» ноября 2010г.
Учёный секретарь

диссертационного совета

кандидат биологических наук Яковлева И.В.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования. Стафилококковая инфекция является одной из важнейших проблем медицинской практики. Staphylococcus aureus вызывает гнойно-воспалительные заболевания различной локализации от легких до генерализованных форм [А.В. Дехнич с соавт, 2008; K. Iwatsuki et al., 2006]. Факторами, определяющими трудности терапии данной патологии, является множественная лекарственная устойчивость возбудителя, хронический характер болезни, а также возникновение заболеваний на фоне снижения резистентности организма к инфекции [В.Н. Ефремова с соавт, 1998; Е.Н. Волкова с соавт, 2004].

Известен целый ряд комплексных вакцин (Бронхо-ваксом®, ИРС-19®, Имудон®, стафило-протейно-синегнойная, Иммуновак-ВП-4®), в состав которых входят антигены стафилококка, и монопрепаратов (Анатоксин стафилококковый очищенный®, Анатоксин стафилококквый адсорбированный®, Антифагин®), обладающих антигенспецифическим, и иммуномодулирующим эффектом. В НИИВС им.И.И. Мечникова разработана и внедрена в производство (на базе ФГУП «НПО «Микроген» МЗСР РФ) поликомпонентная вакцина Иммуновак-ВП-4®. Важным компонентом этой вакцины являются стафилококковые антигены, которые составляют основу противостафилококкового монопрепарата «Стафиловак» (разрешен к применению в практике здравоохранения, приказ МЗ РФ №144/53 от 10 апреля 1996г). Антигены выделены из клеточных стенок 4-х штаммов S. aureus (№№5,9,1986,1991), отобранных ранее из 16 штаммов на основе изучения перекрёстной протективной активности [Л.И. Корзая, 1982; В.Н. Ефремова с соавт, 1998;]. Клинические исследования, проведенные на разных базах, показали, что включение данной вакцины в комплексную терапию хронической стафилококковой инфекции, оказывает длительный терапевтический эффект [С.А. Масюкова с соавт.,1993; Е.В. Сорокина, 2006].

В последние годы появились исследования по сравнительной характеристике вакцинных и выделенных от больных штаммов S.aureus. Выявленные различия в их структуре могут влиять на течение эпидемических и инфекционных процессов [О.Ю. Борисова, 1999; И.Э. Борисова с соавт., 2008; R. Preston et al., 1998; P. Cassiday et al., 2000; S. Gandon et al., 2003]. В связи с развитием вакцинологии в направлении создания новых препаратов генетическая характеристика производственных штаммов, с учётом их факторов патогенности, приобретает особый интерес [В.М. Бондаренко, 1997, 2001; А.Л. Гинцбург с соавт., 1999; С.Ю. Комбарова, 2007]. Это явилось предпосылкой для изучения молекулярно-генетических свойств используемых вакцинных штаммов S. aureus, в частности, определение гена, кодирующего синтез белка А, являющегося одним из факторов патогенности и суперантигеном для В-лимфоцитов, вызывающим их поликлональную активацию, что может привести к подавлению иммунного ответа [Р.М. Хаитов с соавт, 2010].

При изготовлении вакцин Иммуновак-ВП-4® и «Стафиловак» до настоящего времени штаммы стафилококка выращивали на плотной питательной среде. Этот процесс трудоемкий, нетехнологичный и малопроизводительный. Использование реакторного культивирования в жидких питательных средах с последующим отделением биомассы методом микрофильтрации устраняет эти недостатки. Так как стафилококковый компонент является довольно лабильным, возникает необходимость определения возможного влияния технологических изменений на свойства антигенных препаратов, приготовленных из культур, выращенных при периодическом реакторном культивировании. Кроме того, если для препарата Иммуновак-ВП-4® на молекулярно-клеточном уровне изучено действие на систему врождённого и адаптивного иммунитета [Н.К. Ахматова, 2006; Н.К. Ахматова, М.В. Киселевский, 2008], то в отношении стафилококкового компонента таких данных нет.

Цель исследования:

Получение антигенных препаратов из вакцинных штаммов S. aureus, культивируемых на плотных питательных средах и в реакторе, их характеристика (химическая, физико-химическая, иммунохимическая) и изучение влияния на эффекторы врождённого и адаптивного иммунитета.

Для достижения поставленной цели сформулированы следующие задачи:

1. Охарактеризовать вакцинные штаммы S. aureus по наличию в них гена, ответственного за синтез протеина А.

2. Изучить накопление биомассы вакцинных штаммов S. aureus при выращивании в различных питательных средах.

3. Провести исследование антигенных препаратов, полученных при разных способах выращивания S. aureus (при реакторном культивировании в сравнении с выращиванием на плотной среде) по химическим, физико-химическим, иммунохимическим свойствам и специфической активности.

4. Исследовать влияние антигенных препаратов S. aureus на эффекторы врожденного иммунитета (дендритные клетки, натуральные киллеры, макрофаги).

5. Изучить действие антигенных препаратов на систему адаптивного иммунитета (продукция специфических антител, протективная активность).

Научная новизна работы

Впервые исследованы вакцинные штаммы S. aureus (№№ 5, 9, 1986, 1991) на наличие spa гена, ответственного за синтез протеина А, и установлено его присутствие только в штамме №5. Наиболее иммуногенные вакцинные штаммы №№ 1986 и 1991 обладали внутривидовой антигенной активностью: способствовали образованию в сыворотках иммунизированных мышей высокого уровня IgG-антител.

Антигенные препараты, полученные из культур, выращенных в условиях периодического реакторного культивирования и на плотной среде, обладали сопоставимой специфической антигенной активностью, включали полисахаридсодержащие компоненты, общие с поверхностным полисахаридом и тейхоевыми кислотами S. aureus Wood-46.

Показано, что антигенные препараты, полученные из вакцинных штаммов S. aureus, культивируемых разными методами (при периодическом реакторном выращивании и на плотных средах):

- стимулируют созревание дендритных клеток,

- индуцируют киллерную активность мононуклеарных лейкоцитов мышей (МЛ) и периферической крови доноров (МЛПК),

- индуцируют экспрессию про-, противовоспалительных и регуляторных цитокинов,

- усиливают фагоцитарную активность перитонеальных макрофагов мышей,

- стимулируют экспрессию TLR2 и взаимодействуют с ним in vitro,

- стимулируют выработку специфических антител;

- увеличивают численность Т-лимфоцитов (CD3, CD4, CD8), В-лимфоцитов (CD19), T-reg лимфоцитов (CD4/CD25/FoxP3);

- способствуют формированию протективной активности против стафилококковой инфекции.

Практическая значимость работы

Обоснована возможность применения способа периодического реакторного культивирования вакцинных штаммов S. aureus при получении антигенных препаратов для профилактики стафилококковой инфекции. Результаты использованы при разработке производственной технологии реакторного культивирования вакцинных штаммов S. aureus и выделения антигенных препаратов стафилококка, входящих в состав Иммуновак-ВП-4®.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Среди исследованных вакцинных штаммов S. aureus, только штамм №5 содержит spa ген, ответственный за синтез фактора патогенности ― протеина А. Наиболее иммуногенные штаммы (№№ 1986 и 1991) не содержат этот ген.

2. Антигенный препарат, полученный из биомассы вакцинных штаммов S. aureus, выращенных при периодическом реакторном культивировании, по сравнению с препаратом из культур с плотной среды, содержит больше белка и полипептидных компонентов, меньше углеводов.

Препараты сопоставимы по специфической антигенной активности, включают полисахаридсодержащие компоненты, общие с поверхностным полисахаридом и тейхоевыми кислотами стафилококковых препаратов сравнения.

3. Стафилококковые антигенные препараты активируют систему врожденного иммунитета: стимулируют созревание дендритных клеток, индуцируют киллерную активность мононуклеарных лейкоцитов мышей и периферической крови доноров, усиливают фагоцитарную активность перитонеальных макрофагов мышей, стимулируют экспрессию TLR2 на мононуклеарных лейкоцитах и дендритных клетках, взаимодействуют с TLR2 (на модели эмбриональных клеток почки человека), усиливают экспрессию про-, противовоспалительных и регуляторных цитокинов.

4. Установлена способность стафилококковых препаратов активировать адаптивный иммунитет с индукцией высокого уровня IgG-антител и повышением численности активированных Т и В лимфоцитов.

Дендритные клетки, созревшие под влиянием антигенных препаратов, приобретали способность представлять антиген Т лимфоцитам и защищать мышей от стафилококковой инфекции. На примере препарата, полученного при реакторном культивировании, показана протективная активность в отношении стафилококковой инфекции у мышей.

Апробация материалов диссертации и публикации

Основные материалы диссертационной работы доложены на: Объединённом иммунологическом форуме, (Санкт-Петербург, 2008); Международной конференции «Физиология и патология иммунной системы», (Москва, 2008); научно-практической конференции молодых учёных и специалистов НИИВС им. И.И. Мечникова РАМН (Москва, 2008).

Апробация диссертации состоялась 14 сентября 2010 г на совместной конференции отделов микробиологии и иммунологии НИИВС им. И.И. Мечникова РАМН.

По материалам диссертации опубликовано 11 работ, из них 6 - статьи в журналах, рекомендованных ВАК РФ.

Структура и объем диссертации

Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, трёх глав собственных исследований, заключения и выводов. Список цитируемой литературы включает 153 источника, из которых 68 отечественных работ.

Работа изложена на 143 страницах машинописного текста, иллюстрирована 25 рисунками и 27 таблицами.

С О Д Е Р Ж А Н И Е Р А Б О Т Ы

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Штаммы микроорганизмов. В работе использовано 7 штаммов S. aureus: 4 вакцинных штамма (№№ 5, 9, 1986, 1991) и штамм № 6, отобранные ранее по показателям широкой внутривидовой перекрёстной протективной активности из 16 штаммов (11 производственных и 5 выделенных от больных гнойно-воспалительными заболеваниями) [Л.И. Корзая, 1982]; 2 тест-штамма, получены из коллекции музея ФГУН НИИЭМ им. Пастера (Cowan 1 №№ 21/2 и 21/4, содержащие в клеточной стенке белок А).

Экспериментальные животные. Использованы мыши линий СВА, С57Вl/6, BALB/с и беспородные, весом 12-14 и 16-18г (самцы), полученные из питомника НЦ Биомедицинских технологий РАМН «Андреевка», содержащиеся в условиях вивария НИИВС им. И.И. Мечникова РАМН. Животных выводили из эксперимента под эфирным наркозом в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных».

Питательные среды. Штаммы выращивали в жидких (полноценной и полусинтетических) питательных средах и на плотной среде. Изучение накопления биомассы в динамике роста проведено в вариантах сред (табл. 1), из которых №№ 1 и 1а – полноценные среды, включающие панкреатический гидролизат казеина (ПГК) (ФГУН ГНЦ прикладной микробиологии и биотехнологии, г. Оболенск) и дрожжевой экстракт (ДЭ) («Экстракт дрожжевой растворимый», «Биотехновация», Москва). Остальные варианты – полусинтетические среды, в которых к солевой основе – синтетической среде Ледерберга [J. Lederberg, 1950], добавлены глюкоза (ГЛ), дрожжевой экстракт (ДЭ) и аминопептид (АП) («Аминопептид», ООО «Самсон-Мед», Санкт-Петербург).

Таблица 1. Состав питательных сред

Добавки

Среды

Полноценные

Полусинтетические (основа–среда Ледерберга)

Плотная

Жидкие

1а*

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

ПГК, г/л

40

40

-

-

-

-

-

-

-

-

-

ГЛ, г/л

2,0

2,0

2,0

5,0

2,0

5,0

2,0

5,0

2,0

5,0

5,0

ДЭ, г/л

2,0

2,0

2,0

2,0

2,0

2,0

2,0

2,0

3,0

3,0

3,0

АП, мл/л

-

-

-

-

50,0

50,0

100,0

100,0

50,0

50,0

100,0

*3 % агаровая среда

Выявление spa гена, ответственного за синтез протеина А. Исследование проведено совместно с д.м.н. О.Ю. Борисовой (ФГУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора) с использованием нового LAMP-метода, разработанного в Японии [T. Notomi et al., 2000]. Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) – «петлеопосредованная» изотермальная амплификация, основана на свойстве полимеразы, лишенной эндонуклеазной активности, синтезировать новую цепь ДНК, вытесняя цепь с внесенным однонитевым разрывом. Для выделения хромосомной ДНК использовали стандартный метод кипячения. Исследование проведено на основании протокола амплификации, разработанного [Y. Misawa et al., 2007]. В экспериментах использованы: адаптированный состав реакционного буфера, Bst-полимераза и 5 праймеров. Амплификацию выполняли на термоциклере PTC-100 Peltier Effect Cycling, Mj Research Inc (США) в изотермальном режиме: 63 оС – 120 мин и 80 оС – 5 мин. Результаты выявляли в электрофорезе в 2 % агарозном геле при напряжении 160 V, с последующей визуализацией ампликонов в ультрафиолетовом свете.

Способы культивирования. Выращивание S. aureus проводили различными методами:

С использованием планшетного фотометра Multiskan-Ascent: в 96-луночном планшете через 18 часов оценивали накопление биомассы по приращению оптической плотности в опытных ячейках по сравнению с контролем (без культуры).

Реакторное культивирование проводили в ферментере АНКУМ-2М (Россия) с рабочим объёмом 10 л до конца фазы экспоненциального роста. Микробные клетки отделяли микрофильтрацией (через полисульфоновые мембраны УПМ-20 «Владипор», Россия), отмывали от среды и смывали их с мембраны обратным током 1 л стерильной дистиллированной воды.

Выращивание на плотной (агаровой) питательной среде на матрацах 4-х вакцинных штаммов проводили в соответствии с [ПУР № 04863057-80-10].

Получение антигенных препаратов. Микробную взвесь инактивировали ацетоном, клетки отделяли центрифугированием и полученный осадок высушивали при 7 ± 2 ºС до получения рассыпчатого порошка («ацетоновый порошок» или «ацетоновые тела»).

Антигенные препараты получали методом водной экстракции «ацетоновых тел» с последующим отделением надосадочной жидкости путём центрифугирования (в дальнейшем изложении называемые «водные экстракты»). Из водных экстрактов после внесения стабилизирующих добавок (желатин и аскорбиновая кислота) были приготовлены лиофилизированные антигенные препараты, использованные в ряде экспериментов.

Химический и физико-химический анализ препаратов антигенов. Содержание белка, углеводов, нуклеиновых кислот определяли с использованием традиционных методов исследования [O.H. Lowry et al, 1951; M. Dubois et al, 1956; K.H. Wong et al., 1977].

Хромато-масс-спектрометрический анализ (выполнен совместно с д.х.н., проф. Ю.А. Книрелем, Институт органической химии им. Н.Д. Зелинского РАН): для определения моносахаридного состава предварительно гидролизованные 3М трифторуксусной кислотой (120 ºС, 3 ч) антигенные препараты наносили на колонку с анионообменной смолой Dowex АХ8 в 0,5 М натрий-боратном буфере (рН 8,0) и хроматографировали при 70 ºС, используя углеводный анализатор Biotronik LC-2000 (Германия). Содержание отдельных моносахаридов оценивали по площади пиков на хроматограммах и выражали в виде отношения к площади пика галактозамина, принятого за единицу.

Вертикальный SDS электрофорез белковых компонентов проводили в полиакриламидном геле по [Л.А. Остерман, 1981; U.K. Laemmli, 1970], гели окрашивали с помощью серебряного реактива или раствора Coomassie brilliant blue R-250.

Иммунохимический анализ антигенных препаратов.

Препараты сравнения1: клеточные стенки (КС), полученные ультразвуковой дезинтеграцией микробных клеток S. aureus штамм Wood 46 [Н.Е. Ястребова, 1987]; поверхностный полисахарид (ПС), полученный по методу [I.W. Sutherland & J.F. Wilkinson, 1971] из супернатанта культуральной жидкости путем осаждения ацетоном и фенольной депротеинизации; тейхоевые кислоты (ТК), полученные из клеточных стенок [J. Baddiley, 1962] экстракцией трихлоруксусной кислотой. В реакциях использованы иммунные кроличьи сыворотки к S. aureus штамм Wood 46.

Двойную диффузию в геле, линейный и ракетный иммунноэлектрофорез проводили по [Н.А. Зорин, Т.Н. Белогорлова, 1983; O. Ouchterlony, 1958].

Реакцию торможения пассивной гемагглютинации (РТПГА) проводили в 96 луночных планшетах с использованием стафилококкового эритроцитарного диагностикума и иммунной кроличьей сыворотки к S. aureus (полученной при иммунизации кроликов «ацетоновыми телами» наиболее иммуногенных штаммов - №№ 1986 и 1991). Специфическую антигенную активность оценивали по минимальной дозе стафилококковых препаратов со стабилизатором (мкг) или водного экстракта (мкл), тормозящих 2 ГЕ (гемагглютинирующие единицы) сыворотки - минимальная тормозящая доза (МТД) [ПУР № 04863057-80-10].

Иммуноферментный анализ. Уровень IgG-антител к антигенам S. aureus в сыворотках иммунизированных животных определяли с использованием метода непрямого твердофазного иммуноферментного анализа с адсорбцией на носителе антигенных препаратов в 96 луночных планшетах [Н.Е. Ястребова, 2007]. Конъюгат - антитела диагностические против IgG кролика, меченные пероксидазой хрена (производство НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи). Для оценки уровня IgG антител сывороток, характеризующего их антигенную активность, использован индекс (I), рассчитанный по формуле:

, где

ОП им.– оптическая плотность сывороток иммунизированных животных;

ОП фон. – средняя оптическая плотность фона;

ОП к- - средняя оптическая плотность сывороток интактных животных (отрицательный контроль).

Иммунологические методы.

Для оценки взаимодействия антигенных препаратов с Толл-подобными рецепторами (TLR) использовали линии клеток эмбриональной почки человека 293, стабильно экспрессирующие hTLR4/MD2-CD2-CD14 и hTLR2/CD14, а также несущие ген b-галактозидазы под контролем NF-kB-зависимого промотора [Д.В. Шебляков с соавт., 2008]. В качестве положительного контроля экспрессии TLR2 и TLR4 использовали коммерческие препараты, соответственно, синтетический липополисахарид из E. coli (Sigma) и липопептид, любезно предоставленный проф. Б.С. Народицким (НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи). Через 24 часа после добавления исследуемого препарата к клеткам удаляли среду и вносили буфер с субстратом для β-галактозидазы. Уровень активности β-галактозидазы определяли при λ 414 нм.

Мононуклерные лейкоциты перефирической крови доноров (МЛПК) и селезенок мышей (МЛ) выделяли с помощью одноступенчатого градиента плотности фиколл-урографина по методу [A. Boyum, 1968].

Дендритные клетки (ДК) получали из МЛПК доноров и МЛ селезенок мышей линии BALB/с по стандартной методике [Г.З. Чкадуа c соавт., 2002]. Культивирование клеток проводили в присутствии факторов роста (GM-CSF и IL-4). В качестве индукторов созревания использовали антигенные препараты и TNF-α (положительный контроль).

Антигенпрезентирующую способность ДК мышей линии BALB/с оценивали в опытах активной защиты. ДК (3х106), созревшие под действием антигенных препаратов, вводили двукратно подкожно (п/к) и однократно внутрибрюшинно (в/бр) с интервалом 14 суток по 0,5 мл. Через 14 суток после последней инъекции животных заражали 2 млрд. микробных клеток штамма S. aureus 1986 в 0,4 % голодном агаре. Протективную активность оценивали по проценту выживших мышей в опыте и контроле (интактные животные). Выживаемость рассчитывали в динамике по методу [С.А. Гланц, 1999].

Протективную активность препаратов изучали на беспородных мышах массой 12-14 г, иммунизированных дозой 0,5 мг препарата 6-кратно (3 раза – п/к, 3 раза – в/бр) с интервалом 7 дней. Через 14 дней после последней иммунизации и интактных (контроль) мышей заражали тремя пятикратно убывающими дозами вирулентного штамма S. aureus № 6 в 0,4 % голодном агаре. Выживаемость оценивали в течение 7 суток, рассчитывали LD50, доверительный интервал и значимость различий [И.П. Ашмарин, А.А. Воробьёв, 1962; Л.Б. Хейфец, 1965].

Определение экспрессии поверхностных маркеров мононуклеаров и ДК проводили при помощи моноклональных антител («Caltag Laboratories», США) против соответствующих антигенов. Результаты учитывали на проточном цитометре FacsCalibur («Becton Dickinson», США).

Уровень цитокинов определяли:

- в супернатантах культур ДК мышей методом твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА) с использованием тест-систем фирмы Bender MedSystems (Австрия);

- в сыворотках мышей, иммунизированных антигенными препаратами, при помощи тест-системы FlowCytomix Mouse Th1/Th2 10 plex фирмы Bender MedSystems (Австрия). Уровень цитокинов определяли согласно инструкции производителя с использованием проточного цитометра FacsCalibur («Becton Dickinson», США).

Цитотоксическую активность МЛПК доноров и МЛ селезенок мышей определяли на NK чувствительной линии клеток опухоли К-562. Опухолевые клетки (3х104 в 1 мл) инкубировали в культуральной среде с МЛПК или МЛ, обработанными антигенными препаратами, в соотношении 1:5 в плоскодонных 96-луночных планшетах 18 часов в СО2 – инкубаторе при 37 °С и 4 % СО2. Затем в лунки добавляли витальный краситель МТТ («Fluka») и по оптической плотности при λ 540 нм, измеряемой на мультискане МS («Labsystem», Финляндия), рассчитывали процент лизиса опухолевых клеток (процент цитотоксичности).

Фагоцитарную активность перитонеальных макрофагов оценивали по поглотительной способности в отношении штамма S. aureus № 1991, определяли фагоцитарный индекс (ФИ) и число (ФЧ) [В.В. Меньшиков, 1987].

Острую токсичность антигенных препаратов оценивали введением мышам 0,2 мг на особь на основании поведения животных и изменения их веса в течение 7 суток в соответствии с [МУК 4.1/4.2.588-96].

Статистическую обработку результатов проводили с использованием стандартного пакета статистических программ Windows 2003 (StatSoft 7.0), Exel, WinMdi и BioStat D. Достоверность различий между средними показателями оценивали с помощью критерия Стьюдента. Данные представлены как M±m. Различия рассматривались как значимые при p<0,05.
  1   2   3

Похожие:

Характеристика антигенных препаратов, выделенных из вакцинных штаммов Staphylococcus aureus, культивируемых в различных условиях iconЛекарственных препаратов фармакология гомеопатия
Директор Всероссийского государственного научно-исследовательского   института контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных...
Характеристика антигенных препаратов, выделенных из вакцинных штаммов Staphylococcus aureus, культивируемых в различных условиях iconИнструкция по оказанию первой помощи пострадавшему Первая помощь при различных травмах оказывается с использованием перевязочных материалов и лекарственных препаратов, которые находятся в аптечке первой помощи.
Первая помощь при различных травмах оказывается с использованием перевязочных материалов и лекарственных препаратов, которые находятся...
Характеристика антигенных препаратов, выделенных из вакцинных штаммов Staphylococcus aureus, культивируемых в различных условиях iconИнструкция №1 3 по оказанию первой помощи пострадавшему
Первая помощь при различных травмах оказывается с использованием перевязочных материалов и лекарственных препаратов, которые находятся...
Характеристика антигенных препаратов, выделенных из вакцинных штаммов Staphylococcus aureus, культивируемых в различных условиях iconОб утверждении перечня лекарственных препаратов, в том числе перечня лекарственных препаратов, назначаемых по решению врачебной комиссии
Приказ Министерства здравоохранения и социального развития РФ от 18 сентября 2006 г. N 665
Характеристика антигенных препаратов, выделенных из вакцинных штаммов Staphylococcus aureus, культивируемых в различных условиях iconКонспект Тема урока «Классификация и значение витаминов»
Цели: Углубить и обобщить знания учащихся о значении витаминов: содержание их в продуктах питания; условиях сохранения и правила...
Характеристика антигенных препаратов, выделенных из вакцинных штаммов Staphylococcus aureus, культивируемых в различных условиях iconА. П. Кондакова, Н. Г. Жила, М. А. Бояршинов сравнительная характеристика прочности  различных видов сухожильных швов
Павловича, 1 б, e-mail:, тел.: 8-(4212)-23-79-67, г. Хабаровск 
Характеристика антигенных препаратов, выделенных из вакцинных штаммов Staphylococcus aureus, культивируемых в различных условиях iconОб итогах исполнения Управлением Росздравнадзора по Алтайскому краю государственной функции по мониторингу безопасности лекарственных препаратов, находящихся в обращении на территории Российской Федерации за июнь 2012 года
Количественные показатели выявления нежелательных реакций лекарственных препаратов на территории
Характеристика антигенных препаратов, выделенных из вакцинных штаммов Staphylococcus aureus, культивируемых в различных условиях iconРаспоряжение Правительства РФ от 11 ноября 2010 г. N 1938-р "Об утверждении перечня жизненно необходимых и важнейших лекарственных препаратов на 2011 год" (с изменениями от 6 апреля, 3 ноября 2011 г.)
В целях обеспечения государственного регулирования цен на лекарственные препараты, включенные в перечень жизненно необходимых и важнейших...
Характеристика антигенных препаратов, выделенных из вакцинных штаммов Staphylococcus aureus, культивируемых в различных условиях iconПо медицинскому применению лекарственного средства  стокрин / stocrin  регистрационный номер: 
...
Характеристика антигенных препаратов, выделенных из вакцинных штаммов Staphylococcus aureus, культивируемых в различных условиях iconФормирование структуры сообщества донных макробеспозвоночных животных в различных экологических условиях (на примере рек Среднего Урала)

Разместите кнопку на своём сайте:
kak.znate.ru


База данных защищена авторским правом ©kak.znate.ru 2012
обратиться к администрации
KakZnate
Главная страница