Механизмы влияния сигнальных белков апоптоза на функциональное состояние вазопрессинергических нейронов гипоталамуса




Скачать 322.13 Kb.
НазваниеМеханизмы влияния сигнальных белков апоптоза на функциональное состояние вазопрессинергических нейронов гипоталамуса
страница1/3
НИКИТИНА Любовь Сергеевна
Дата конвертации24.10.2013
Размер322.13 Kb.
ТипАвтореферат
  1   2   3


На правах рукописи

НИКИТИНА

Любовь Сергеевна

МЕХАНИЗМЫ ВЛИЯНИЯ СИГНАЛЬНЫХ БЕЛКОВ АПОПТОЗА НА ФУНКЦИОНАЛЬНОЕ СОСТОЯНИЕ ВАЗОПРЕССИНЕРГИЧЕСКИХ НЕЙРОНОВ ГИПОТАЛАМУСА
03.03.01 – Физиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук


Санкт-Петербург

2009

Работа выполнена в лаборатории сравнительной сомнологии и нейроэндокринологии Учреждения Российской академии наук Института эволюционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова РАН

Научный руководитель: кандидат биологических наук

Черниговская Елена Валерьевна
Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Аврова Наталья Федоровна
доктор биологических наук,

Ордян Наталья Эдуардовна
Ведущее научное учреждение: Учреждение Российской академии наук Институт цитологии и генетики Сибирского отделения РАН


Защита диссертации состоится «9» февраля 2010 года в 11 часов на заседании диссертационного совета (Д 002.127.01) при Учреждении Российской академии наук Институте эволюционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова РАН по адресу: 194223, г. Санкт-Петербург, пр. М. Тореза, 44

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института эволюционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова РАН (194223, г. Санкт-Петербург, пр. М. Тореза, 44).
Автореферат разослан «______» _____________ 2009 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

доктор биологических наук, профессор М.Н. Маслова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы
Исследование сигнальных белков апоптоза в настоящее время в основном сфокусировано на анализе механизмов их взаимодействия в процессе регуляции клеточного цикла и апоптоза различных типов клеток. Особенный интерес вызывает роль белков апоптоза в нейронах, пролиферация и массовая программированная гибель которых заканчивается в раннем онтогенезе, но белки апоптоза продолжают синтезироваться в дифференцированных нейронах в течение всей жизни организма. Существование экспрессии сигнальных белков апоптоза в дифференцированных жизнеспособных нейронах позволяют предположить возможность их участия в процессах напрямую с апоптозом не связанных, однако данных об участии белков апоптоза в регуляции нейрональной активности в настоящее время чрезвычайно мало. В частности, было показано, что белки семейства BCL-2 (B-cell lymphoma 2), помимо регуляции митохондриального пути апоптоза [Kroemer et al., 1997], участвуют в регуляции роста аксонов [Jiao et al., 2005], и необходимы для осуществления синаптической пластичности [Fannjiang et al., 2003; Hickman et al., 2008; Jonas et al., 2003]. Транскрипционный фактор p53 (tumor protein 53) также является полифункциональным белком. Помимо регуляции клеточного цикла и апоптоза [Lane, 1993], p53 также участвует в регуляции экспрессии глюкокортикоидных рецепторов [Nishimura et al., 2004].

На основании результатов, полученных Черниговской с соавторами, и исходя из литературных данных, очевидно, что Bcl-2 и p53 экспрессируются в значительном количестве в нейронах ЦНС, в частности, в гипоталамических нейронах у взрослых интактных животных. Показано, что стресс, в том числе дегидратация (специфическое воздействие, вызывающее активацию вазопрессинергических нейросекреторных клеток) приводит к усилению экспрессии в них белков апоптоза (Bcl-2, p53), не вызывая гибель нейронов [Chernigovskaya et al., 2005; Nishimura et al., 2004]. Более того, показано, что нокаут генов, кодирующих p53 и Bcl-2, влияет на специфические функции вазопрессинергических и катехоламинергических нейронов на уровне синтеза и выведения нейрогормонов из тел клеток [Chernigovskaya et al., 2005], что свидетельствует о важной роли белков апоптоза в регуляции функциональной активности нейронов. Очевидно, что белки апоптоза не являются основными регуляторами функциональной активности нейронов. Более вероятно, что Bcl-2 и p53 оказывают модулирующее влияние на биосинтез нейропептидов. Однако непосредственные мишени Bcl-2 и p53 в регуляции функциональной активности нейронов мозга пока не обнаружены.

Показано, что Bcl-2 и p53 активируют ERK1/2 сигнальный каскад (киназный каскад, регулируемый внеклеточными сигналами) [Singh et al., 2007; Wang et al., 1996], который, вовлечен в регуляцию пролиферации и дифференцировки клеток [Pearson et al., 2001]. Кроме того, существуют немногочисленные данные об участии ERK1/2 каскада в регуляции биосинтеза ряда нейротрансмиттеров [Arima et al., 2002; Ma et al., 2005]. Взаимодействие ERK1/2 каскада с сигнальными белками апоптоза в регуляции функциональной активности нейронов не изучалось.

Вазопрессинергические нейросекреторные нейроны гипоталамуса являются хорошей моделью для изучения возможности и механизмов участия Bcl-2 и p53 в регуляции нейрональной активности в связи с высокой секреторной активностью этих нейронов, позволяющей дифференциально оценивать изменения уровня синтеза и темпов выведения вазопрессина. Механизмы регуляции транспорта и выведения вазопрессинергических секреторных гранул к настоящему времени остаются слабо изученными. Анализ малочисленных литературных данных показал, что одним из белков, непосредственно осуществляющих антероградный транспорт, может быть кинезин [Senda, Yu, 1999]. Непосредственное изучение роли кинезина в реализации антероградного транспорта вазопрессина также практически не проводилось. Механизмы регуляции биосинтеза вазопрессина исследуются уже на протяжении нескольких десятилетий, и на первый взгляд являются хорошо изученными. Одним из ключевых факторов, отвечающих за транскрипцию вазопрессина нейронами гипоталамуса, является цАМФ. Промотор гена вазопрессина содержит CRE (cAMP response element), с которым связывается транскрипционный фактор CREB (cAMP response element binding protein), который в вазопрессинергических нейросекреторных нейронах гипоталамуса регулируется преимущественно протеинкиназой А [Burbach et al., 2001]. На основании экспериментов in vitro в различных типах клеток показано, что в фосфорилировании и активации CREB помимо протеинкиназы А, участвуют также другие протеинкиназы, в том числе относящиеся к ERK1/2 каскаду [Johannessen et al., 2004]. Более того, существуют данные об участии ERK1/2 сигнального каскада в регуляции циркадианного ритма экспрессии гена вазопрессина нейронами супрахиазматического ядра [Arima et al., 2002]. Несмотря на то, что протеинкиназа А очевидно не является единственной киназой, регулирующей транскрипцию вазопрессина за счет активации транскрипционного фактора CREB, данных о возможном участии ERK1/2-каскада в регуляции экспрессии вазопрессина нейронами супраоптического ядра гипоталамуса в литературе найдено не было.

Таким образом, очевидна необходимость детального исследования взаимодействия сигнальных белков апоптоза Bcl-2 и p53 с ERK1/2-каскадом и транскрипционным фактором CREB в регуляции функциональной активности вазопрессинергических нейронов гипоталамуса. Актуальность изучения этой проблемы основана на важности понимания механизмов взаимодействия различных белков апоптоза с другими внутриклеточными посредниками в функционировании клетки в физиологических условиях и при патологии.
Целью исследования было изучение механизмов влияния сигнальных белков апоптоза на функциональную активность вазопрессинергических нейронов гипоталамуса крыс. Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

Задачи:

  1. Оценить возможность участия, характер и механизмы влияния ERK1/2 сигнального каскада на функциональную активность вазопрессинергических нейронов супраоптического ядра гипоталамуса.

  2. Исследовать характер прямого влияния антиапоптозного белка Bcl-2 на активность киназ ERK1/2 сигнального каскада и транскрипционных факторов Elk1 и CREB, а также на синтез и скорость выведения вазопрессина нейронами гипоталамуса.

  3. Изучить характер прямого влияния проапоптозного белка p53 на активность киназ ERK1/2 сигнального каскада и транскрипционных факторов Elk1 и CREB, а также на синтез и скорость выведения вазопрессина нейронами супраоптического ядра.


Научная новизна
Впервые была выявлена активация киназ ERK1/2 каскада и транскрипционных факторов Elk1 и CREB в вазопрессинергических нейронах гипоталамуса при водной депривации. Впервые было установлено, что киназы ERK1/2 сигнального каскада участвуют в регуляции синтеза и секреции вазопрессина нейронами супраоптического ядра гипоталамуса. Была показана зависимость распределения транспортного белка кинезина от активности ERK1/2 киназы.

Впервые было установлено активирующее влияние антиапоптозного белка Bcl-2 и транскрипционного фактора CREB на активность синтеза вазопрессина.

Впервые было выявлено активирующее влияние p53 на секрецию вазопрессина нейронами супраоптического ядра гипоталамуса, выражавшееся в регуляции транспорта и выведения нейрогормона. Было показано, что p53 влияет на интенсивность секреции вазопрессина за счет активации ERK1/2 киназы.

Основные положения, выносимые на защиту


  1. ERK1/2 сигнальный каскад вызывает активацию транскрипционных факторов Elk1 и CREB, что приводит к усилению синтеза вазопрессина нейронами гипоталамуса, а также участвует в регуляции секреции вазопрессина, вызывая увеличение синтеза транспортного белка кинезина.

  2. Антиапоптозный белок Bcl-2 и транскрипционный фактор CREB участвуют в активации синтеза вазопрессина независимо от ERK1/2 сигнального каскада.

  3. Проапоптозный белок p53 оказывает модулирующее активирующее действие на секрецию вазопрессина, и это влияние опосредовано ERK1/2 киназой.


Теоретическая и практическая значимость
Исследование имеет фундаментальное значение для понимания роли сигнальных белков апоптоза Bcl-2 и p53 в модуляции функциональной активности вазопрессинергических нейронов, что открывает новые перспективы в изучении взаимозависимости функциональной активности нейронов и их жизнеспособности. Понимание механизмов взаимодействия различных белков апоптоза с внутриклеточными посредниками лежит также в основе разработки новых подходов к лечению онкологических заболеваний, а также ряда нейродегенеративных заболеваний, патогенез которых связан с нарушением баланса про- и антиапоптозных белков. Более того, к настоящему времени блокаторы Bcl-2 и p53 (HA14-1 и Pifithrin- соответственно) используются в терапии онкологических заболеваний периферических тканей, в связи с чем необходимо учитывать возможность влияния этих фармакологических агентов на центральную нервную систему. Полученные в работе данные могут быть использованы в курсах лекций для студентов биологических и медицинских факультетов университетов и медицинских институтах.
Апробация работы
Результаты исследования доложены и обсуждены на 1 Съезде физиологов СНГ (Дагомыс, 2005), на XIII международном совещании по эволюционной физиологии (Санкт-Петербург, 2006), на 5 международной конференции по функциональной нейроморфологии «Колосовские чтения-2006» (Санкт-Петербург, 2006), на 6-th ICN (Питтсбург, США 2006), на XX съезде физиологического общества имени И.П. Павлова (Москва, 2007), на Всероссийском симпозиуме с международным участием «Гормональные механизмы адаптации» (Санкт-Петербург, 2007), на Международной конференции «Apoptosis World 2008. From mechanisms to applications» (Люксембург, 2008), на Конференции с международным участием “Нейрохимические механизмы формирования адаптивных и патологических состояний мозга” (С.-Петербург, 2008), на 11-ой Всероссийской медико-биологической конференции молодых исследователь «Человек и его здоровье» (Санкт-Петербург, 2008), на 4th Conference on Advances in Molecular Mechanisms of Neurological Disorders (Лейпциг, Германия, 2009).
Публикации
По теме диссертации опубликовано 19 работ, 2 из которых – статьи в рецензируемых журналах, 17 тезисов докладов.
Финансовая поддержка работы

Работа выполнена при содействии Российского Фонда Фундаментальных исследований (проекты 05-04-48099 и 08-04-00028)
Структура и объем диссертации
Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов исследования, обсуждения результатов, выводов и списка литературы, включающего 16 отечественных и 165 зарубежных источников. Работа изложена на 159 страницах машинописного текста, иллюстрирована 2 таблицами и 49 рисунками.
ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Для изучения возможности участия сигнальных белков апоптоза и киназ ERK1/2 сигнального каскада в регуляции функциональной активности вазопрессинергических нейронов гипоталамуса мы провели эксперименты, в которых взрослых крыс линии Вистар подвергали водной депривации. Животных опытной группы (n=11) в течение 3-х дней содержали в клетках со свободным доступом к сухому корму, но без воды. Крысы контрольной группы (n=11) имели свободный доступ к воде и корму. Животных декапитировали по окончании водной депривации.

Для изучения механизмов влияния p53 на активность вазопрессинергических клеток супраоптического ядра были проведены эксперименты in vivo. Селективный блокатор p53 Pifithrin- вводили крысам (n=11) внутрибрюшинно в концентрации 2 мг/кг. Животным контрольной группы (n=11) вводили растворитель блокатора диметилсульфоксид (ДМСО) на физиологическом растворе в концентрации 0,5%. Животных декапитировали через 5 часов после введения растворов.

Для исследования механизмов прямого влияния p53 и Bcl-2 были проведены опыты in vivo с внутригипоталамическим введением блокаторов Bcl-2 – HA14-1 и p53 – Pifithrin-. Для введения блокаторов за 7-10 дней до начала экспериментов наркотизированным крысам (нембутал в дозе 60мг/кг, интраперитонеально) вживляли проводящие канюли в область третьего желудочка мозга (AP1,4; L0,8; H6,5 в мм в соответствии со стереотаксическим атласом [Paxinos, Watson, 1998]). В работе были использованы 3 группы животных (n=15). Крысам контрольной группы вводили растворитель блокаторов (физиологический раствор, содержащий 0,5% ДМСО). Крысам второй группы вводили НА14-1 - блокатор Bcl-2 (0,5 мг/кг). Животные третьей группы были подвергнуты введению Pifithrin- в дозе 0,25 мг/кг. Фармакологические агенты вводились дважды за 36 часов и за 8 часов до забора материала. Также, через 2 часа после каждого введения блокаторов, у животных всех экспериментальных групп оценивали уровень диуреза в течение двух часов в метаболических камерах. Крыс декапитировали на 8-11 день после имплантации канюль через 8 часов после последнего введения фармакологических агентов.

Для изучения прямого влияния инактивации Bcl-2, p53 или ERK1/2 сигнального каскада на функциональную активность вазопрессинергических нейронов супраоптического ядра, были выполнены эксперименты in vitro с использованием блокаторов HA14-1, Pifithrin- или UO126 соответственно. Исследования in vitro проводились на переживающих срезах гипоталамуса. Животных (n=66) декапитировали, быстро извлекали мозг и в стерильных условиях из гипоталамической области иссекали срезы толщиной около 600 мкм. Для экспериментов с использованием блокаторов HA14-1 и UO126 иссекались фронтальные срезы гипоталамуса, содержащие супраоптические и паравентрикулярные ядра. Для экспериментов с применением блокатора Pifithrin- иссекались горизонтальные срезы, содержание супраоптические, паравентрикулярные ядра и гипофиз. Срезы инкубировались в СО2 инкубаторе в среде ДМЕМ, содержащей 20% инактивированной сыворотки крови лошади и антибиотики (пенициллин в дозе 50 мкг/мл среды и стрептомицин – 100 мкг/мл), в течение 30 минут при температуре 370С, концентрации СО2 5% и влажности 95%. Затем среду меняли на инкубационную среду такого же состава, содержащую блокаторы (HA14-1 в дозе 30 мкМ или Pifithrin- в дозе 10 мкМ или UO 126 в дозе 25 мкМ), или растворители блокаторов (ДМСО в концентрации 0,5%) в качестве контроля. Срезы инкубировались в течение 5 часов.

По окончании всех экспериментов по 5 мозгов или срезов гипоталамуса на группу фиксировали 4% формальдегидом для дальнейшего морфологического исследования. Из другой части мозгов или срезов иссекали супраоптические ядра и заднюю долю гипофиза, которые далее гомогенизировали в буфере, содержащем блокаторы пептидаз и фосфатаз, для последующего биохимического анализа.
Иммуногистохимия

Иммуногистохимическую обработку проводили по стандартной методике: 1. Инкубация с первичными поликлональными антителами кролика к вазопрессину (1: 200), кинезину (1:250) (Abcam), Bcl-2 (1:200) (Santa Cruz Biotechnology Inc.), p53 (1:100), фосфо-CREB(Ser133) (1:100), фосфо-cRaf (Ser338) (1:100), (Cell Signaling) (1:100), фосфо-MEK1/2(Ser217/221) (1:100), фосфо-ERK1/2(Thr202/Tyr204) (1:120), ERK (1:100), фосфо-Elk1(Ser383) (1:30) фосфо-p90RSK(Ser380) (1:30) (Cell Signaling Technology). 2. Инкубация с вторичными биотинилированными антителами (Vector Labs). 3. Нанесение Стрептавидин-пероксидазного комплекса 1:200 (Vector Labs). 4. Проявление реакции проводилось диаминобензидином.
Конфокальная микроскопия.

Для исследования распределения исследуемых белков апоптоза и участников ERK1/2 сигнального каскада в гипоталамо-гипофизарной нейросекреторной системе срезы гипоталамуса обрабатывали иммуногистохимически с применением первичных поликлональных антител против кролика к вазопрессину, который выявляли с помощью вторичных антител, конъюгированных с Alexa Fluor 568 (Invitrogen). P53, фосфо-ERK1/2(Thr202/Tyr204), фосфо-Elk1(Ser383) и фосфо-CREB(Ser133) выявляли на тех же срезах с помощью первичных мышиных моноклональных антител и вторичных антител, конъюгированных с Alexa Fluor 488 (Invitrogen). Анализ препаратов проводили на конфокальном микроскопе (Leica).
Вестерн блотт анализ

Содержание исследуемых белков в пробах, содержащих лизат супраоптического ядра или задней доли гипофиза оценивали методом Вестерн-блот. Белки, выделенные из лизатов разгоняли на SDS-PAGE, затем переносили на нитроцеллюлозу. В качестве первичных антител использовали антитела Bcl-2 (1:500, Santa-Cruz Inc.), фосфо-CREB(Ser133) (1:500, Chemicon), kinesin (1:750, Abcam); p53 (1:750), фосфо-ERK1/2 (Thr202/Tyr204).(1:1000), ERK1/2(1:1000), фосфо-Elk1(Ser383) (1:500), фосфо-MEK1/2(Ser217/221) (1:500), фосфо-cRaf(Ser 338) (1:500) – Cell Signaling, GAPDH (1:2000, Abcam). Для визуализации результатов использовали ECL plus–систему (Amersham Biosciences). Денситометрический анализ проводили с помощью программы PhotoM. Уровень экспрессии специфических белков был скорректирован по сигналу GAPDH, выявляемый для определения уровня общего количества белка в пробах.

  1   2   3

Похожие:

Механизмы влияния сигнальных белков апоптоза на функциональное состояние вазопрессинергических нейронов гипоталамуса iconМолекулярные основы дизрегуляции программированной гибели лимфоцитов при хронической вирусной инфекции
Обсуждаются молекулярные механизмы модулирования реализации апоптоза иммунокомпетентных клеток персистирующими вирусами
Механизмы влияния сигнальных белков апоптоза на функциональное состояние вазопрессинергических нейронов гипоталамуса iconПрограмма дисциплины Аналитические центры как субъекты политики: механизмы влияния на выработку политических решений (Think Tanks as Actors in Public Policy: the Mechanism of Influencing Political Decision-making) для направления 030200. 68 «Политология»
Аналитические центры как субъекты политики: механизмы влияния на выработку политических решений
Механизмы влияния сигнальных белков апоптоза на функциональное состояние вазопрессинергических нейронов гипоталамуса iconВлияние компьютерного видеодисплейонго терминала на функциональное состояние и умственную работоспособность школьников
Тема: Влияние компьютерного видеодисплейонго терминала на функциональное состояние и умственную работоспособность школьников
Механизмы влияния сигнальных белков апоптоза на функциональное состояние вазопрессинергических нейронов гипоталамуса iconФунКционаЛьное СоСТояние ПоЧеК и нижниХ  МоЧеВыВодящиХ ПуТеЙ В динаМиКе доСТаТоЧноГо  дВуХфаЗноГо МенСТруаЛьноГо циКЛа
Результаты гормонального обследования приведены в табл. 1 и совпадают с популяцион
Механизмы влияния сигнальных белков апоптоза на функциональное состояние вазопрессинергических нейронов гипоталамуса iconВ. Н. Щеглов Предложена алгоритмическая модель слабых взаимодействий и синхронизации ультраструктур нейронов, основанная на алгоритме построения алгебраических моделей конструктивной логики амкл интуиционистского
Алгоритмическая модель слабых взаимодействий и синхронизации ультрастуктур нейронов
Механизмы влияния сигнальных белков апоптоза на функциональное состояние вазопрессинергических нейронов гипоталамуса iconИсследование связи "человек-животное"
Обе формы эксперимента с высокой достоверностью продемонстрировали способность оператора дистанционно воздействовать на функциональное...
Механизмы влияния сигнальных белков апоптоза на функциональное состояние вазопрессинергических нейронов гипоталамуса icon  интернет И язык: основные механизмы взаимо- влияния В современном обществе  
Не  всегда  потребитель  выделяет  тот  смысл  названия,  который  имел  в  виду 
Механизмы влияния сигнальных белков апоптоза на функциональное состояние вазопрессинергических нейронов гипоталамуса iconПрограмма
Примеры  простых  и  сложных  белков.  Функции  белков  в  клетке.  Ферменты,  их 
Механизмы влияния сигнальных белков апоптоза на функциональное состояние вазопрессинергических нейронов гипоталамуса iconЗадачи. Актуализировать представления о факторах, влияющих на проявление тех или иных эмоций; развивать навыки произвольного влияния на собственное эмоциональное состояние. Материалы
Цели. Познакомить учащихся с эмоциями; научить определять эмоциональное состояние других людей; тренировать умение владеть своими...
Механизмы влияния сигнальных белков апоптоза на функциональное состояние вазопрессинергических нейронов гипоталамуса iconЛитература
Анализ исследования влияния аэробных и анаэробных упражнений на состояние организма
Разместите кнопку на своём сайте:
kak.znate.ru


База данных защищена авторским правом ©kak.znate.ru 2012
обратиться к администрации
KakZnate
Главная страница