автореферат разослан «22»  сентября 2010 г. 




Скачать 137.5 Kb.
PDF просмотр
Название  автореферат разослан «22»  сентября 2010 г. 
страница3/4
Дата конвертации19.07.2013
Размер137.5 Kb.
ТипАвтореферат
1   2   3   4

 
 
научно-практической  конференции  с  международным  участием  «Современные  проблемы 
сердечно-сосудистой, легочной и абдоминальной хирургии», посвященной 100-летию со дня 
рождения  академика  РАМН  Ф.Г.Углова  (Санкт-Петербург, 2004); на  конференции 
«Клиническая трансплантация органов» (Москва, 2005); на IX Ежегодной сессии НЦССХ и 
Всероссийской  конференции  молодых  ученых  (Москва, 2005); на III Всемирном  Конгрессе 
по  регенеративной  медицине  (Лейпциг, 2007); на  Британско-Российском  совещании  в 
сотрудничестве с Европейской комиссией (Москва, 2007), на IV Всероссийском симпозиуме 
с международным участием «Актуальные вопросы тканевой и клеточной трансплантологии» 
(Санкт-Петербург, 2010). 
 
1.7 Объем и структура диссертации 
 
Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов 
исследований,  результатов  и  их  обсуждения,  выводов  и  списка  цитируемой  литературы, 
включающего 181 источник.  Диссертация  изложена  на 111 страницах  машинописного 
текста. Иллюстративный материал содержит 35 рисунков и 3 таблицы. Работа выполнялась в 
рамках  Гос.контракта  № 02.522.11.2006/03 и  при  поддержке  гранта  Российского  фонда 
фундаментальных исследований.  
 
2.  МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 
 
2.1 Клеточные культуры 
Фибробласты  выделяли  методом  миграции  из  фрагментов  нормальной  и  рубцовой 
кожи взрослых доноров, а также из эмбриональной кожи. В качестве нормальной и рубцовой 
кожи  взрослых  доноров  была  использована  кожа  лица,  полученная  в  результате 
косметологических  операций.  Эмбриональные  фибробласты  кожи  были  выделены  из  кожи 
эмбриона  позднего  срока  развития,  изъятого  в  результате  кесарева  сечения.  Клетки 
культивировали в среде DMEM (ICN) c добавлением 10 % эмбриональной бычьей сыворотки 
(Gibco) в атмосфере 5 % CO2 при температуре 37 °C. В работе были использованы клетки на 
третьем-восьмом пассажах. 
 
2.2 Трехмерное культивирование фибробластов 
Трехмерное  культивирование  фибробластов  разного  происхождения  осуществляли 
путем введения клеток в формируемые коллагеновый или фибриновый гели.  

 

 
 
Для  приготовления  коллагенового  геля  смешивали  коллаген I типа,  полученный  по 
стандартной  методике (Chandrakasan et al., 1967), стерильный 0.34 М  раствор NaOH (для 
подведения pH 7.0) и концентрированную (10×) питательную среду 199 (для выравнивания 
ионной силы). В полученную смесь добавляли суспензию фибробластов в питательной среде 
ДМЕМ (ICN), содержащей 10 % эмбриональной бычьей сыворотки (Gibco).  
Для  приготовления  фибринового  геля  в  раствор  фибриногена (Calbiochem) с 
концентрацией 2 мг/мл добавляли суспензию фибробластов в среде ДМЕМ, содержащей  
10 % эмбриональной  бычьей  сыворотки.  Затем  для  образования  фибрина  вводили 1 ед 
тромбина (Sigma) на 0.1 мл геля.  
Конечная  концентрация  фибробластов  в  обоих  вариантах  гелей  составляла 1×106 
кл/мл,  конечная  концентрация  коллагена  − 2 мг/мл,  фибрина  − 1 мг/мл.  Аликвоты 
приготовленной  смеси  по 0.1 мл  вносили  в  лунки 96-луночной  платы  и  инкубировали  в 
атмосфере 5 % CO2 при температуре 37 °C до полной полимеризации геля. Затем в каждую 
лунку  добавляли  по 0.1 мл  питательной  среды  ДМЕМ,  содержащей 10 % эмбриональной 
бычьей сыворотки. Гели, с заключенными в них фибробластами, культивировали в течение 
10 сут.  
 
2.3 Иммунофлуоресцентный анализ организации цитоскелета  
В  качестве  субстратов  для  распластывания  клеток  были  использованы  белки  ВКМ: 
коллаген I и IV типов, ламинин 2/4 и фибронектин. Коллаген I типа получен из сухожилий 
крысиных хвостов (Chandrakasan et al., 1967), коллаген IV типа и ламинин 2/4 выделены из 
плаценты  человека  (Черепанова  и  др., 2002; Kleinman, 1994; Palm, Furcht, 1983;), 
фибронектин получен из плазмы крови человека (Ruoslanti et al., 1982).  
 
Покровные  стекла  покрывали  вышеперечисленными  белками  с  концентрацией 10 
мкг/мл  и  инкубировали  в  течение  ночи  при +4 °С.  Затем  отмывали PBS и  для  исключения 
неспецифического  связывания  с  субстратом  обрабатывали 2 %-ным  раствором  бычьего 
сывороточного  альбумина (BSA) в  течение 1 ч  при 37 °С.  Суспензию  фибробластов, 
выделенных  из  нормальной,  рубцовой  и  эмбриональной  кожи,  наносили  в  концентрации 
1×105 кл/мл в 0.1 мл среды без сыворотки на покровные стекла, покрытые лигандами. После 
инкубации в течение 60 мин в атмосфере 5 % СО2 при температуре 37 °С среду удаляли и 
промывали  раствором PBS. Прикрепившиеся  клетки  фиксировали 4 %-ным  формалином, 
отмывали PBS и обрабатывали 0.1 %-ным Тритоном Х100 в течение 15 мин при комнатной 
температуре. 
Для  выявления  фокальных  контактов  клетки  инкубировали  с  моноклональными 

 
1   2   3   4

Похожие:

  автореферат разослан «22»  сентября 2010 г.  icon  автореферат разослан  «    » сентября 2010 года. 

  автореферат разослан «22»  сентября 2010 г.  icon  автореферат разослан 15 сентября 2009 г. 
Декларации  принципов  толерантности  (1995  г.).  В  преамбуле  характеризуется 
  автореферат разослан «22»  сентября 2010 г.  icon  автореферат разослан «       » сентября 2007 г. 
Гоу впо «Российский государственный   профессионально-педагогический университет»  
  автореферат разослан «22»  сентября 2010 г.  iconАвтореферат разослан 30 сентября 2006 года. 
Терминология.  В  диссертационной  работе,  для  изложения  результатов  исследования 
  автореферат разослан «22»  сентября 2010 г.  icon  автореферат диссертации разослан  «  6  »  сентября   2011 года 
Ведущая организация:                              Учреждение Российской академии наук 
  автореферат разослан «22»  сентября 2010 г.  icon  автореферат разослан « 14 »  октября  2010 года. 
Удк [535. 343+544. 541]: 29. 19. 22                                                На правах рукописи 
  автореферат разослан «22»  сентября 2010 г.  icon  автореферат разослан «      »                     2010 г. 
С  диссертацией  можно  ознакомиться  в  библиотеке  гоу  впо  «Санкт-Петер- бургская государственная лесотехническая академия им. С....
  автореферат разослан «22»  сентября 2010 г.  icon  автореферат разослан « 2 »  ноября  2010 года. 
На  1  января  2009  года  в  Италии  зарегистрировано  почти  4  млн.  279  тыс. 
  автореферат разослан «22»  сентября 2010 г.  icon  автореферат разослан “             “                         “ 2003 г. 

  автореферат разослан «22»  сентября 2010 г.  icon  автореферат разослан «08» октября 2007 г. 

Разместите кнопку на своём сайте:
kak.znate.ru


База данных защищена авторским правом ©kak.znate.ru 2012
обратиться к администрации
KakZnate
Главная страница