автореферат диссертации разослан  «  6  »  сентября   2011 года 




Скачать 167.54 Kb.
PDF просмотр
Название  автореферат диссертации разослан  «  6  »  сентября   2011 года 
страница9/11
Дата конвертации20.12.2012
Размер167.54 Kb.
ТипАвтореферат
1   2   3   4   5   6   7   8   9   10   11


(у  дикого типа) активатором экспрессии становится гуанин. Таким  образом, специфичность 
связывания  сенсорной  РНК  pbuE  с  аденином  действительно  определяется  присутствием 
основания  U    в  положении  70,  и,  вероятней  всего,  обусловлена  предсказанным  Уотсон-
Криковским  взаимодействием  эффектора  аденина  с  урацилом  в  А-боксе.  Замена  U70→С 
нарушает  это  взаимодействие  и  меняет  специфичность  узнавания  сенсорной  РНК 
метаболита-эффектора, но фенотипическое проявление изменения специфичности сенсорной 
РНК  pbuE    наблюдается  только  на  фоне  дополнительной  нуклеотидной  замены  A100→G, 
которая восстанавливает шпилечную структуру  терминатора транскрипции (рис. 8).  
3.  Реконструкция пуринового метаболизма у Bacillus subtilis с целью получения 
штамма-продуцента AICAR (акадезина)  – перспективного кандидата в 
лекарственные препараты широкого терапевтического применения. 
Как  уже  отмечалось  выше  pur-оперон  B.  subtilis  кодирует  ферменты  синтеза  IMP  –  
главного  промежуточного  соединения    при  биосинтезе  пуриновых  нуклеотидов.    В 
результате  реакции  на  восьмом  этапе  пути  биосинтеза  пуринов  (рис.  12)  образуется  5-
аминоимидазол-4-карбоксамидрибофуранозид или сокращенно – АИКАР (AICAR), который 
так  же  известен  под  названием  «акадезин»  (acadesine).  Впоследствии  выяснилось,  что  это 
соединение обладает высочайшим потенциалом для терапии различных социально-значимых 
заболеваний.  Соответственно  создание  штамма-продуцента,  обеспечивающего  накопление 
AICAR  в  культуральной  жидкости  (КЖ),  в  концентрации  достаточной  для  дальнейшего 
производства лекарственной субстанции, является интересной и весьма актуальной задачей. 
Целью  этого  раздела  является  получение  штамма-продуцента  AICAR  путем 
направленной реконструкции пуринового метаболизма у B. subtilis
На первом этапе работы по получению штамма-продуцента AICAR необходимо было 
обеспечить  максимальную  экспрессию  генов  pur-оперона  путем  устранения  его  негативной 
регуляции  под  действием  белка-репрессора  PurR  и  терминатора  транскрипции  в  лидерной 
области  оперона.  После  этого  в  геноме  полученного  штамма  была  получена  делеция  гена 
purH,  кодирующего  синтез  фермента  AICAR  трансформилазы/IMP  циклогидролазы. 
Инактивация  этого  фермента  должна  обеспечивать  внутриклеточное  накопление  AICAR 
(рис. 12). 
 
Рисунок 12. Схема биосинтеза AICAR. 
16 
 

Аббревеатура:  R-5-P  –  рибозо-5’-фосфат,  PRPP  –  5’-фосфорибозил-1-пирофосфат,  PRA  –  5'-
фосфорибозиламин, 
GAR 
– 
5’-фосфорибозилглицинамид, 
FGAR 
– 
5’-фосфорибозил-N-
формилглицинамид,  FGAM  –  5'-фосфорибозил-N-формилглицинамид,  AIR  –  5'-фосфорибозил-5-
аминоимидазол,  CAIR  –  5’-фосфорибозил-5-аминоимидазол-4-карбоксилат,  SAICAR  –  5’-
фосфорибозил-4(N-сукцинокарбоксамид)-5-аминоимидазол, 
AICAR-P 
– 
5'-фосфорибозил-4-
карбоксамид-5-аминоимидазол,  FAICAR  –  5’-фосфорибозил-4-карбоксамид-5-формамидоимидазол, 
IMP – инозин-5’-монофосфат, AICAR – 5-аминоимидазол-4-карбоксамидрибофуранозид.  
На  следующем  этапе  работы  необходимо  было  увеличить  пул  основного 
предшественника синтеза пуринов de novo – PRPP. Синтез PRPP осуществляется из рибозо-
5-фосфата под контролем фермента PRPP-синтазы, кодируемой геном prs. Активность этого 
фермента  подвержена  аллостерической  регуляции  с  участием  пуриновых  нуклеотидов. 
Структурно-функциональная организация PRPP-синтазы, более детально изучена у бактерий 
E.  coli,  у  которых  получен  мутантный  вариант  этого  фермента  со  снятой  аллостерической 
регуляцией.  Учитывая  эти  данные,    был  проведен  сайт-направленный  мутагенез  гена  prs  E. 
coli  для  получения  мутантного  фермента  со  снятым  ретроингибированием  пуриновыми 
нуклеотидами с целью его последующего переноса в клетки B. subtilis.  
Еще  одним  препятствием  для  усиления  продукции  AICAR  является  наличие 
аллостерической  регуляции  у  первого  фермента  собственно  пуринового  биосинтеза  – 
глютамин-PRPP-аминотрансферазы, кодируемой геном purF. Известно, что глютамин-PRPP-
аминотрансфераза    из  E.  coli,  в  отличие  от  соответствующего  фермента  B.  subtilis,    не 
подвержена инактивации в стационарной стадии роста бактерий. Кроме того, у E. coli описан 
мутантный  вариант  этого  фермента,  устойчивый  к  ингибированию  пуриновыми 
нуклеотидами.  Поэтому  и  в  этом  случае  было  решено  использовать  модифицированный  с 
помощью сайт-направленного мутагенеза фермент глютамин-PRPP-аминотрансферазы  из E. 
coli  с  целью  его  последующего  переноса  в  клетки  B.  subtilis.  Для  обеспечения  оптимальной 
экспрессии  клонированных  из  E.  coli  модифицированных  генов  prs  и  purF  в  клетках  B. 
subtilis  на  основе  плазмиды  pDG268  был  сконструирован  экспрессионный  интегративный 
вектор,  содержащий  сильный  промотор  гена  rpsF,  кодирующего  синтез  рибосомного  белка 
S6. Наконец, на последнем этапе работы после клонирования генов prs и purF под контролем 
промотора  гена  rpsF    в  составе  полученного  вектора,  была  проведена  его  интеграция    в 
хромосому  штамма-продуцента  AICAR  B.  subtilis.  В  итоге  работы  получен  штамм-
продуцент, накапливающий 11-13 г/л  AICAR в КЖ. 
  3.1. Определение продуктивности штаммов в отношении накопления AICAR 
Для  оценки  продуктивности  полученных  в  ходе  работы  штаммов  в  отношении 
накопления  AICAR  проводились  опыты  по  ферментации.  Результаты  этих  опытов 
суммированы на рис. 13.  
Как  следует  из  данных,  представленных  на  рис.  13,  исходный  штамм  АМ732 
практически  совсем  не  накапливает  AICAR.  Только  после  внесения  в  геном  этого  штамма 
делеции гена purH  (штамм АМ793) наблюдается незначительное (<1 г/л) накопление AICAR 
17 
 
1   2   3   4   5   6   7   8   9   10   11

Похожие:

  автореферат диссертации разослан  «  6  »  сентября   2011 года  icon  автореферат диссертации разослан «30» октября 2012 года. 
В. С. Елистратова,  С. И. Левиковой,  В. М. Мокиенко,  Т. Г. Никитиной  и  др.,  со
  автореферат диссертации разослан  «  6  »  сентября   2011 года  icon  автореферат разослан  «    » сентября 2010 года. 

  автореферат диссертации разослан  «  6  »  сентября   2011 года  iconАвтореферат разослан 30 сентября 2006 года. 
Терминология.  В  диссертационной  работе,  для  изложения  результатов  исследования 
  автореферат диссертации разослан  «  6  »  сентября   2011 года  icon  автореферат разослан 15 сентября 2009 г. 
Декларации  принципов  толерантности  (1995  г.).  В  преамбуле  характеризуется 
  автореферат диссертации разослан  «  6  »  сентября   2011 года  icon  автореферат разослан «22»  сентября 2010 г. 
В  настоящее  время  одной  из  актуальных  проблем  современной  регенеративной 
  автореферат диссертации разослан  «  6  »  сентября   2011 года  icon  автореферат разослан «       » сентября 2007 г. 
Гоу впо «Российский государственный   профессионально-педагогический университет»  
  автореферат диссертации разослан  «  6  »  сентября   2011 года  icon  автореферат разослан       апреля 2008 года 

  автореферат диссертации разослан  «  6  »  сентября   2011 года  icon  автореферат разослан « 2 »  ноября  2010 года. 
На  1  января  2009  года  в  Италии  зарегистрировано  почти  4  млн.  279  тыс. 
  автореферат диссертации разослан  «  6  »  сентября   2011 года  icon  автореферат разослан « 13  » апреля 2007 года 
Ведущая организация: фгу  Всероссийский государственный центр                                            
  автореферат диссертации разослан  «  6  »  сентября   2011 года  iconАвтореферат диссертации на соискание ученой степени
Защита   диссертации   состоится   19   октября   2012   г.   в   11   часов   на   заседании 
Разместите кнопку на своём сайте:
kak.znate.ru


База данных защищена авторским правом ©kak.znate.ru 2012
обратиться к администрации
KakZnate
Главная страница