Как следует из рис. 10 наиболее выраженный активирующий эффект на экспрессию
гена pbuE B. subtilis оказывают 2,6-диаминопурин и аденин (примерно 10-кратное
повышение активности по сравнению с базальным уровнем). Добавление аденозина
приводит к 5-кратному увеличению экспрессии гена pbuE. Весьма вероятно, что
стимулирующее действие аденозина обусловлено его внутриклеточным фосфоролизом до
аденина, который является истинным эффектором А-бокса. Еще менее выражен
стимулирующий эффект на экспрессию гена pbuE гуанозина, тогда как добавление
гипоксантина, инозина или нефосфорилированного предшественника IMP – 5-
аминоимидазол-4-карбоксамидрибофуранозида (AICAR) вообще никак не сказывается на
экспрессии транскрипционного фьюза pbuE-lacZ. Весьма примечателен тот факт, что в
отличие от AICAR, его нерибозилированная форма – основание 5-аминоимидазол-4-
карбоксамид (AICA) обнаруживает свойства эффектора А-бокса и обусловливает 2,5-кратное
увеличение экспрессии гена pbuE. Из этого следует, что, несмотря на то, что AICA
представляет собой разомкнутую структуру пуринового кольца, присутствие в его составе
дополнительной аминогруппы, видимо, делает его похожим на аденин и обеспечивает
возможность связывания с сенсорной РНК.
2.3. Сайт-направленный мутагенез лидерной области гена pbuE
Для выяснения функциональной роли отдельных нуклеотидов лидерной области
мРНК гена pbuE был проведен сайт-направленный мутагенез лидерной области гена pbuE.
Нуклеотидные замены были получены в сайтах, расположенных в основании шпилек P2/P2’
(замены 21С→G, 22С→G) и P3/P3’ (замены 50C→G, 51A→U) – рис. 8. Кроме того, была
получена мутация 70U→С, которая, по имеющимся данным, должна влиять на
специфичность связывания А-бокса с аденином в качестве положительного эффектора
транскрипции. Следует отметить, что эта нуклеотидная замена, по всей видимости, должна
одновременно нарушать спаривание нуклеотидов в основании шпильки, формирующей
терминатор транскрипции, и, тем самым, влиять на уровень экспрессии гена pbuE (рис. 8).
Поэтому была получена компенсирующая нуклеотидная замена 100A→G, которая должна
восстанавливать шпилечную структуру терминатора. Полученные мутантные варианты
клонировали в составе вектора pDG268 для конструирования транскрипционных фьюзов
pbuE-lacZ, а затем интегрировали в хромосомный локус amyE штамма B. subtilis Mu8u5u6,
как описано в работе.
2.4. Характеристика мутантов, содержащих замены в лидерной области гена pbuE.
У отобранных рекомбинантов, содержащих инсерции транскрипционных фьюзов
лидерной области гена pbuE дикого типа и его мутантных вариантов, определяли активность
β-галактозидазы в различных физиологических условиях. Результаты этих опытов
представлены на рис. 11.
14
Рисунок 11. Влияние пуриновых оснований на экспрессию лидера pbuE дикого типа и его
мутантных вариантов.
Ночные культуры штамма B. subtilis Mu8u5u6, содержащие в составе хромосомы транскрипционные
фьюзы pbuE-lacZ разводились в 50 раз в свежей среде Спицайзена и растили при 37оС до OD600=0.2,
затем в соответствующие пробы добавляли пуриновые основания: аденин (А), гуанин (G) и
гипоксантин (H) в концентрации 1мМ и растили еще 2 часа перед определением активности β-
галактозидазы. Активность β-галактозидазы выражена в единицах Миллера. Приведенные значения
активности – средние из 4 независимых определений.
Как следует из данных, представленных на рис. 11, базальный уровень экспрессии
транскрипционного фьюза лидера гена pbuE дикого типа с реперным геном lacZ очень низок
и активируется более чем в 100 раз при добавлении аденина в среду для роста. Добавление
гуанина приводит примерно к 10-кратному увеличению экспрессии pbuE-lacZ, тогда как
гипоксантин на экспрессию этой конструкции практически не влияет. У мутантов,
содержащих нуклеотидные замены 21С→G, 22С→G (мутант pbuE-M1) и 50С→G, 51A→U
(мутант pbuE-M2) наблюдается низкий уровень экспрессии pbuE-lacZ, который не
увеличивается при добавлении пуриновых оснований. Из этого следует, что частичное
разрушение шпилечных структур P2/P2’ и P3/P3’ полностью инактивирует сенсорные
свойства лидерной РНК в отношении пуринов. Этот результат подтверждает модель
трехмерной структуры А-бокса, согласно которой формированию домена, ответственного за
связывание аденина предшествует взаимодействие шпилечных структур P2/P2’ и P3/P3’.
Присутствие в лидерной области нуклеотидной замены U70→С (мутант pbuE-M3)
приводит к конститутивной экспрессии pbuE, причем добавление пуринов уже практически
не сказывается на уровне активности мутантного фьюза (рис. 11), что подтверждает данные
работы. Как уже отмечалось выше, конститутивная экспрессия этого мутанта, вероятней
всего, обусловлена частичным разрушением терминирующей шпильки.
Особый интерес представляет результат внесения на фоне мутации U70→С
дополнительной замены A100→G (мутант pbuE-M5) в левом плече терминатора
транскрипции (рис. 8). Как следует из рис. 11, именно у двойного мутанта наблюдается
изменение специфичности связывания А-бокса с пуриновыми основаниями – вместо аденина
15
|
