автореферат диссертации разослан  «  6  »  сентября   2011 года 




Скачать 167.54 Kb.
PDF просмотр
Название  автореферат диссертации разослан  «  6  »  сентября   2011 года 
страница7/11
Дата конвертации20.12.2012
Размер167.54 Kb.
ТипАвтореферат
1   2   3   4   5   6   7   8   9   10   11

гипоксантин,  а  аденин,  поэтому  аптамерный  участок  лидерной  мРНК  гена  pbuE  получил 
наименование  А-бокса.  Другая  интересная  особенность  А-бокса  состоит  в  том,  что  в 
присутствии аденина наблюдается не репрессия, а активация транскрипции гена pbuE. Таким 
образом,  если  в  случае  гена  xpt    добавление  экзогенных  гуанина  и  гипоксантина 
стабилизирует  терминирующую  шпильку,  то  в  случае  гена    pbuE  присутствие  аденина 
приводит  к  такому  изменению  конформации    лидерной  области,  при    которой  структура 
терминатора  транскрипции  разрушается  и  обеспечивается  сквозная  транскрипция 
структурной части гена. Любопытно, что в областях лидерной мРНК, расположенных между 
шпильками,  нуклеотидные  последовательности  гуанин-регулируемой  xpt  мРНК  и  аденин-
регулируемой  pbuE мРНК обнаруживаются всего три различия. Примечательно, что одна из 
замен  расположена  между  шпильками  P3/P3’  и  P1/P1’:  это  основание  75С  в  гуанин-
регулируемой   xpt  мРНК (G-бокс) и основание 70U в аденин-регулируемой мРНК гена pbuE 
(А-бокс)  –  рис.  8.    Было  высказано  предположение,  что  именно  это  различие  определяет 
специфичность  связывания  соответствующих  аптамеров  с  метаболитами-эффекторами,  так 
как гуанин и гипоксантин может спариваться с основанием 75С в G-боксе, тогда как аденин  
–  с  основанием  70U  в  А-боксе  в  результате  классического  Уотсон-Криковского 
взаимодействия.  Это  предположение  подтверждается  данными  in  vitro,  согласно  которым, 
константа связывания аденина с мутантным А-боксом резко снижается, а гуанина, напротив, 
повышается,  а  также  результатами  опубликованного  рентгеноструктурного  анализа 
трехмерной  структуры  А-бокса  гена  pbuE  B.  subtilis.  Однако,  на  фенотипическом  уровне 
изменение специфичности А-бокса не проявлялось: введение нуклеотидной замены 70U→С 
в  А-бокс  приводило  к  конститутивной,  не  регулируемой  пуринами  экспрессии  гена  pbuE
Таким  образом,  механизм  функционирования  А-бокса  in  vivo,  в  частности,  вопрос  о 
корреляции  между  его  сенсорными  свойствами  и  способностью  модулировать  экспрессию 
гена pbuE, требует дальнейших исследований. 
Настоящий  раздел  посвящен  мутационному  анализу  лидерной  области  гена  pbuE  B. 
subtilis  с  целью  выяснения  роли  отдельных  нуклеотидов  в  определении  специфичности 
сенсорной мРНК гена pbuE в отношении связывания эффекторов - пуриновых  оснований, а 
также изучения влияния полученных мутаций на экспрессию гена pbuE. 
2.1. Определение старта транскрипции гена pbuE 
Прежде  чем  приступить  к  мутационному  анализу  лидерной  области  гена  pbuE
необходимо было более точно определить старт транскрипции, так как по литературным его 
локализация 
установлена 
лишь 
приблизительно. 
Локализацию 
сайта 
инициации 
транскрипции  определяли  методом  «достройки  праймера».  Как  следует  из  рис.  9, 
транскрипция гена pbuE  инициируется с нуклеотида А в положении +1 , а не с нуклеотида А 
в положении +8 (рис. 7), как это предполагалось ранее. 
12 
 



 
Рисунок 9. Определение сайта инициации транскрипции  методом «достройки праймера» с 
использованием  P32-меченного праймера Y7. 
Стрелкой указан основной транскрипт, образующийся  в реакции удлинения праймера. 
3.2.2. Влияние пуриновых производных на экспрессию гена pbuE. 
 
Согласно  литературным  данным,  наиболее  активным  метаболитом-эффектором 
сенсорной  РНК  гена  pbuE  является  аналог  аденина  2,6-диаминопурин  с  константой 
диссоциации  10  нмоль  (против  300  нмоль  для  аденина).  Гуанин  обнаруживает  значительно 
более  низкую  константу  связывания  с  А-боксом  (порядка  30  мкмоль),  а  гипоксантин, 
ксантин и другие аналоги пуриновых оснований вообще не проявляют свойства эффекторов  
в  отношении  этой  сенсорной  РНК.  Важно  подчеркнуть,  что  все  данные  по  изучению 
взаимодействия  пуриновых  производных  с  А-боксом  были  получены  в  системе  in  vitro.  В 
связи  с  этим  интересно  было  изучить  влияние  потенциальных  эффекторов  А-бокса  на 
экспрессию  гена  pbuE  в  живых  клетках.  С  этой  целью  были  получены  транскрипционные 
фьюзы  гена    pbuE  с  реперным  геном  lacZ  с  их  последующей  интеграцией  в  хромосомный 
локус  amyE  штамма  B.  subtilis  Mu8u5u6.  У  полученных  штаммов  определяли  активность  β-
галактозидазы в присутствии различных пуриновых производных (рис. 10). 
 
Рисунок 10. Эффект пуриновых оснований и их аналогов на экспрессию гена pbuE B. subtilis 
Условные обозначения: DAP- 2,6-Диаминопурин; Ade – Аденин; Hx – Гипоксантин; AICAR – 5-
Аминоимидазол-4-карбоксамидрибофуранозид.; AICA –5-Аминоимидазол-4-карбоксамид; GR – 
Гуанозин; AR – Аденозин; IR – Инозин. 
13 
 
1   2   3   4   5   6   7   8   9   10   11

Похожие:

  автореферат диссертации разослан  «  6  »  сентября   2011 года  icon  автореферат диссертации разослан «30» октября 2012 года. 
В. С. Елистратова,  С. И. Левиковой,  В. М. Мокиенко,  Т. Г. Никитиной  и  др.,  со
  автореферат диссертации разослан  «  6  »  сентября   2011 года  icon  автореферат разослан  «    » сентября 2010 года. 

  автореферат диссертации разослан  «  6  »  сентября   2011 года  iconАвтореферат разослан 30 сентября 2006 года. 
Терминология.  В  диссертационной  работе,  для  изложения  результатов  исследования 
  автореферат диссертации разослан  «  6  »  сентября   2011 года  icon  автореферат разослан 15 сентября 2009 г. 
Декларации  принципов  толерантности  (1995  г.).  В  преамбуле  характеризуется 
  автореферат диссертации разослан  «  6  »  сентября   2011 года  icon  автореферат разослан «22»  сентября 2010 г. 
В  настоящее  время  одной  из  актуальных  проблем  современной  регенеративной 
  автореферат диссертации разослан  «  6  »  сентября   2011 года  icon  автореферат разослан «       » сентября 2007 г. 
Гоу впо «Российский государственный   профессионально-педагогический университет»  
  автореферат диссертации разослан  «  6  »  сентября   2011 года  icon  автореферат разослан       апреля 2008 года 

  автореферат диссертации разослан  «  6  »  сентября   2011 года  icon  автореферат разослан « 2 »  ноября  2010 года. 
На  1  января  2009  года  в  Италии  зарегистрировано  почти  4  млн.  279  тыс. 
  автореферат диссертации разослан  «  6  »  сентября   2011 года  icon  автореферат разослан « 13  » апреля 2007 года 
Ведущая организация: фгу  Всероссийский государственный центр                                            
  автореферат диссертации разослан  «  6  »  сентября   2011 года  iconАвтореферат диссертации на соискание ученой степени
Защита   диссертации   состоится   19   октября   2012   г.   в   11   часов   на   заседании 
Разместите кнопку на своём сайте:
kak.znate.ru


База данных защищена авторским правом ©kak.znate.ru 2012
обратиться к администрации
KakZnate
Главная страница