автореферат диссертации разослан  «  6  »  сентября   2011 года 




Скачать 167.54 Kb.
PDF просмотр
Название  автореферат диссертации разослан  «  6  »  сентября   2011 года 
страница5/11
Дата конвертации20.12.2012
Размер167.54 Kb.
ТипАвтореферат
1   2   3   4   5   6   7   8   9   10   11


эффекторов. В то же время, мутант AM612-М8, содержащий нуклеотидные замены, которые 
увеличивают  область  спаривания  в  шпильке  Р1/P1’,  напротив,    характеризуется  резким 
снижением  активности  по  сравнению  с  диким  типом,  причем  и  в  этом  случае  экзогенные 
основания  практически  перестают  оказывать  репрессирующее  действие  на  экспрессию  pur-
оперона.    На  основании  данных  рис.  5    можно  заключить,  что  негативное  действие 
эффекторов – гуанина и гипоксантина –  реализуется за счет их взаимодействия с участками 
лидера,  расположенными  между  шпильками  Р1/P1’-Р2/P2’,  Р2/P2’-Р3/P3’  и  Р3/P3’-Р1/P1’. 
Для проверки этого предположения были поставлены эксперименты in vitro
1.4. Опыты in vitro по идентификации эффекторов сенсорной РНК pur-оперона.  
Согласно  модели  рибопереключателей,  низкомолекулярные  эффекторы  –  пуриновые 
основания  должны  непосредственно  связываться  с  лидерной  РНК  в  процессе  ее 
транскрипции  и  обусловливать  терминацию  путем  стабилизации  структуры  G-бокса  в 
конформации  анти-антитерминатора.  В  отсутствие  эффектора-пурина  будет  формироваться 
структура  антитерминатора  и  терминация  должна  супрессироваться.  Для  проверки  этого 
механизма  была  реконструирована  система  аттенюации  транскрипции  in  vitro,  в  состав 
которой  входит  препарат  холофермента  РНК-полимеразы  E.  coli  и  полученные  с  помощью 
ПЦР  матрицы  purE-лидерной  области,  включающие  интактный  промотор.  После 
формирования  инициирующего  комплекса,  содержащего  [32P]  меченую  по  3’-концу 
лидерную  РНК,  проводилась  достройка  РНК  до  конца  матрицы  в  присутствии  или 
отсутствии  аденина,  гуанина  и  гипоксантина.  Изменения  в  эффективности  терминации  в 
ответ на добавление каждого из пуринов оценивались с помощью гель электрофореза путем 
расчета  соотношения  между  полноразмерными  и  укороченными  транскриптами  Серия 
матриц,  содержащих  мутации,  охарактеризованные  in  vivo  в  предыдущем  разделе,  также 
была проверена в аналогичных  in vitro экспериментах  (рис. 6).  
 
Рисунок 6. Эффект пуриновых оснований на транскрипцию лидерной области pur-оперона 
Условные  обозначения  матриц: wt  –  АМ612, дикий  тип;  М2  –  AM612-M2,  (T47→C); М4  –  AM612-
M4,  (T51→C);  М6  –  AM612-M6,  (С76→T);  М7  –  AM612-M7,  ∆(44-54);  M8  –  AM612-M8,  (T22→G, 
A23→T, A24→C). 
Как  следует  из  электрофореграмм,  представленных  на  рис.  6,    при  использовании  в 
качестве  матрицы  лидерной  ДНК  дикого  типа  примерно  16%  purE  РНК  терминирует  на 
терминаторе  в  отсутствии  эффекторов.  Добавление  аденина  никак  не  сказывается  на 

 

распределении транскриптов, тогда как в присутствии высоких концентраций гипоксантина 
(100  мкМ)  терминируется  примерно  50%  РНК,  а  гуанина  –  до  60%  даже  при  низкой 
концентрации  (1  мкМ)  этого  основания.  В  соответствии  с  данными,  полученными  in  vivo
мутантные  варианты  матриц    (М2,  М4,  М6  и  М7)  характеризуются  сниженным  уровнем 
терминации  независимо  от  присутствия  или  отсутствия  гуанина.  Что  касается  мутантной 
матрицы М8, то для нее характерно существенное увеличение уровня терминации (до 50%), 
которое  наблюдается  в  случае  матрицы  дикого  типа  при  добавлении  в  транскрипционную 
смесь гипоксантина или гуанина. 
Таким  образом,  результаты  экспериментов  in  vitro  свидетельствуют  о  том,  что 
пуриновые  основания  гуанин  и,  в  меньшей  степени,  гипоксантин  напрямую  связываются  с 
лидерной РНК pur-оперона и способствуют более эффективной терминации транскрипции.  
1.5. 
Синергидный  эффект  мутации  в  регуляторном  локусе  purR  и  делеции 
терминатора транскрипции в лидерной области на экспрессию pur-оперона.  
Для  того  чтобы  оценить  относительный  вклад  негативной  регуляции  под  контролем 
белка-репрессора  PurR,  действующей  на  уровне  инициации  транскрипции,    и  регуляции  с 
участием  сенсоной  РНК  на  уровне  терминации  транскрипции,  была  сконструирована  серия 
изогенных штаммов B. subtilis, содержащих транскрипционные фьюзы в гене purH: в геноме 
штамма  дикого  типа  (штамм  AM733),  на  фоне  инсерции    purR::neo  (АМ754),  делеции 
терминатора транскрипции purE ∆TL (АМ747) и у штамма АМ769, сочетающего комбинацию 
этих  мутаций.  У  полученных  штаммов  определяли  активность  β-галактозидазы  при 
выращивании бактерий в условиях экспоненциального роста культур (Таблица 1). 
Таблица 1. 
Активность β-галактозидазы в экстрактах штаммов B. subtilis 
Штамм 
Генотип 
Активность 
Уровень 
β-галактозидазы  дерепрессии 
AM733 
purH::(pMutin2purH’-lacZ) 
15±2 

АМ747 
purH::(pMutin2purH’-lacZ) ∆TL 
135±10 

АМ754 
purH::(pMutin2purH’-lacZ) purR::neo 
260±18 
17 
АМ769 
purH::(pMutin2purH’-lacZ) ∆TL purR::neo 
3200±130 
210 
Как  следует  из  данных  табл.1,  на  фоне  делеции  терминаторной  шпильки  лидерной 
области  pur-оперона  наблюдается  9-кратное  увеличение  активности  β-галактозидазы  у 
штамма  АМ747,  содержащего  гибридный  оперон  purH’-lacZ.  При  внесении  инсерции 
purR::neo,  блокирующей  синтез  белка-репрессора  PurR  экспрессия  реперного  гена 
увеличивается в 17 раз по сравнению со штаммом дикого типа АМ733. Интересно отметить, 
что  на  фоне  обеих  мутаций    наблюдается  ярко  выраженный  синергидный  эффект:  уровень 
экспрессии  гибридного  оперона  purH’-lacZ    увеличивается  драматически    (в  210  раз),  что 
существенно  превышает  сумму  эффектов  этих  мутаций  в  отдельности.  Таким  образом, 
максимальный уровень дерепрессии pur-оперона  обеспечивается только при одновременном 
устранении  негативной  регуляции  под  действием  белка    PurR  и    удалении  терминатора 
транскрипции в лидерной области оперона. 

 
1   2   3   4   5   6   7   8   9   10   11

Похожие:

  автореферат диссертации разослан  «  6  »  сентября   2011 года  icon  автореферат диссертации разослан «30» октября 2012 года. 
В. С. Елистратова,  С. И. Левиковой,  В. М. Мокиенко,  Т. Г. Никитиной  и  др.,  со
  автореферат диссертации разослан  «  6  »  сентября   2011 года  icon  автореферат разослан  «    » сентября 2010 года. 

  автореферат диссертации разослан  «  6  »  сентября   2011 года  iconАвтореферат разослан 30 сентября 2006 года. 
Терминология.  В  диссертационной  работе,  для  изложения  результатов  исследования 
  автореферат диссертации разослан  «  6  »  сентября   2011 года  icon  автореферат разослан 15 сентября 2009 г. 
Декларации  принципов  толерантности  (1995  г.).  В  преамбуле  характеризуется 
  автореферат диссертации разослан  «  6  »  сентября   2011 года  icon  автореферат разослан «22»  сентября 2010 г. 
В  настоящее  время  одной  из  актуальных  проблем  современной  регенеративной 
  автореферат диссертации разослан  «  6  »  сентября   2011 года  icon  автореферат разослан «       » сентября 2007 г. 
Гоу впо «Российский государственный   профессионально-педагогический университет»  
  автореферат диссертации разослан  «  6  »  сентября   2011 года  icon  автореферат разослан       апреля 2008 года 

  автореферат диссертации разослан  «  6  »  сентября   2011 года  icon  автореферат разослан « 2 »  ноября  2010 года. 
На  1  января  2009  года  в  Италии  зарегистрировано  почти  4  млн.  279  тыс. 
  автореферат диссертации разослан  «  6  »  сентября   2011 года  icon  автореферат разослан « 13  » апреля 2007 года 
Ведущая организация: фгу  Всероссийский государственный центр                                            
  автореферат диссертации разослан  «  6  »  сентября   2011 года  iconАвтореферат диссертации на соискание ученой степени
Защита   диссертации   состоится   19   октября   2012   г.   в   11   часов   на   заседании 
Разместите кнопку на своём сайте:
kak.znate.ru


База данных защищена авторским правом ©kak.znate.ru 2012
обратиться к администрации
KakZnate
Главная страница