автореферат диссертации разослан  «  6  »  сентября   2011 года 




Скачать 167.54 Kb.
PDF просмотр
Название  автореферат диссертации разослан  «  6  »  сентября   2011 года 
страница4/11
Дата конвертации20.12.2012
Размер167.54 Kb.
ТипАвтореферат
1   2   3   4   5   6   7   8   9   10   11


1.2. Сайт-направленный мутагенез  лидерной области pur-оперона. 
Сайт-направленный  мутагенез  проводили  методом  ПЦР  с  использованием 
специфических  праймеров,  содержащих  нуклеотидные  замены  в  участках  лидерной  РНК, 
которые  предположительно  влияют  на  формирование  ее  вторичной  структуры  или  на 
связывание  сенсорной  РНК  с  эффекторами.  Расположение  всех  полученных  мутаций  в 
лидерной области pur-оперона показано на рис. 2 и 3. 
Как показано на этих рисунках, мутанты AM612-M1 (A44→G), AM612-М2 (T47→C), 
AM612-М3  (T48→C),  AM612-M4  (T51→C)  и  AM612-M5  (C53→T)  содержат  нуклеотидные 
замены  в  области  лидера,  расположенной  между  шпильками  Р2/P2’  и  Р3/P3’,  а  мутант 
AM612-M6 (С76→T) – между шпильками Р3/P3’ и Р1/P1’. Кроме того, получен делеционный 
мутант  AM612-M7  ∆(44-54),  который  содержит  делецию  всего  спейсерного  участка  между 
шпильками  Р2/P2’  и  Р3/P3’,  а  также  мутант  AM612-М8,  содержащий  три  нуклеотидные 
замены  (T22→G,  A23→T,  A24→C),  которые  увеличивают  область  спаривания  в  шпильке 
Р1/P1’  (рис.  3).  Все  полученные  мутации  клонированы  в  составе  экспрессионного  вектора 
pDG268 с целью последующего изучения эффекта этих мутаций на уровень экспрессии purE. 
1.3. Изучение экспрессии транскрипционных  фьюзов purE-lacZ в клетках B. subtilis. 
Для  изучения  механизма  регуляции  pur-оперона  были  проведены  эксперименты  по 
определению 
активности 
β-галактозидазы  у  штаммов  B.  subtilis,  содержащих 
интегрированные  в  хромосому  транскрипционные  фьюзы  purE-lacZ.  Прежде  всего,  мы 
сравнили  экспрессию  pur-оперона  в  штамме  пуринового  ауксотрофа  Mu8u5u6  (purF), 
содержащего  регуляторный  локус  purR  дикого  типа,  и  изогенного  штамма  АМ521  с 
нарушенным  синтезом  репрессора  PurR  (purF  purR::neo)  в  различных  физиологических 
условиях: в присутствии экзогенных пуриновых оснований гуанина, гипоксантина и аденина 
и в их отсутствии. Результаты этих опытов представлены на диаграммах рис. 4. 
 
Рисунок 4. Сравнение экспрессии транскрипционных фьюзов purE-lacZ в штаммах  
B. subtilis purF  и  purF purR::neo
Аббревеатура: Hyp – гипоксантин, G – гуанин, A – аденин.  
Как  следует  из  данных  диаграмм,  экспрессия  фьюза  purE-lacZ    в  штамме    purF 
характеризуется  чувствительностью  к  добавлению  всех  трех  пуриновых  оснований,  тогда 
как  в  клетках  штамма  purF  purR::neo  аденин  не  оказывает  подавляющего  действия  на 
экспрессию  pur-оперона.  Из  этого  следует,  что  аденин  является  эффектором  регуляции, 

 


которая  осуществляется  белком-репрессором  PurR  на  уровне  инициации  транскрипции, 
тогда как действие гуанина и гипоксантина реализуется скорее всего на уровне терминации 
транскрипции. Поэтому в дальнейшей работе мы использовали штамм purF purR::neo
На  рис.  5  представлены  результаты  определения  активности  β-галактозидазы    у 
штамма  purF  purR::neo,  содержащего  в  составе  хромосомы  транскрипционные  фьюзы 
лидера purE дикого типа и его мутантные варианты, описанные в предыдущем разделе. 
 
Рисунок 5. Влияние пуриновых оснований на экспрессию лидерной области pur-оперона 
дикого типа и его мутантных вариантов. 
Условные обозначения: M1 – AM612-М1 (А44→G); M2 – AM612-М2 (T47→C); M3 – AM612-
M3 (T48→C); M4 – AM612-М4 (T51→C); M5 – AM612-M5 (C53→T); М6 – AM612-M6, (С76→T); М7 
– 
AM612-M7, ∆(44-54); M8 – AM612-M8, (T22→G, A23→T, A24→C). 
Как  следует  из  рис.  5,  по  фенотипическому  проявлению  мутанты,    содержащие 
замены  в  области  лидера,  расположенной  между  шпильками  Р2/P2’  и  Р3/P3’  могут  быть 
разделены  на  два  класса.  У  мутантов  первого  класса  AM612-М1  (А44→G),  AM612-M3 
(T48→C)  и  AM612-M5  (C53→T),  наблюдается  некоторое  снижение  базального  уровня 
экспрессии  реперного  гена  lacZ  по  сравнению  с  транскрипционным  фьюзом,  содержащим 
лидерную  область  дикого  типа,  причем  добавление  пуриновых  оснований  приводит  к 
заметному  снижению  уровня  экспрессии  β-галактозидазы  у  мутантов,  хотя  и  в  меньшей 
степени,  чем  у  контрольного  варианта  дикого  типа.    Мутанты  второго  класса  AM612-М2 
(T47→C)  и  AM612-М4  (T51→C)  также  обнаруживают  небольшое  снижение  базального 
уровня  экспрессии  β-галактозидазы,  однако,  в  отличие  от  мутантов  первого  класса,  этот 
уровень  практически  не  снижается  при  добавлении  пуриновых  оснований.  Эти  данные 
указывают  на  важную  роль  спейсерной  области  между  шпильками  Р2/P2’  и  Р3/P3’  в 
узнавании  и  связывании  пуриновых  оснований,  которые  служат  негативными  эффекторами 
регуляции  pur-оперона.  С  этим  согласуется  поведение  мутанта  AM612-М7,  содержащего 
делецию всей спейсерной области между шпильками Р2/P2’ и Р3/P3’, который обнаруживает 
полностью дерепрессированный уровень экспрессии pur-оперона (рис. 5). 
Любопытно,  что  к  такому  же  эффекту  полной  нечувствительности  к  негативному 
действию  пуриновых  оснований  приводит  нуклеотидная  замена    С76→T  в  спейсерной 
области  между  шпильками  Р3/P3’  и  Р1/P1’,  содержащаяся  в  мутанте  AM612-М6,  что 
свидетельствует  о  ключевой  роли  цитозина  в  положении  76  в  узнавании  пуриновых 

 
1   2   3   4   5   6   7   8   9   10   11

Похожие:

  автореферат диссертации разослан  «  6  »  сентября   2011 года  icon  автореферат диссертации разослан «30» октября 2012 года. 
В. С. Елистратова,  С. И. Левиковой,  В. М. Мокиенко,  Т. Г. Никитиной  и  др.,  со
  автореферат диссертации разослан  «  6  »  сентября   2011 года  icon  автореферат разослан  «    » сентября 2010 года. 

  автореферат диссертации разослан  «  6  »  сентября   2011 года  iconАвтореферат разослан 30 сентября 2006 года. 
Терминология.  В  диссертационной  работе,  для  изложения  результатов  исследования 
  автореферат диссертации разослан  «  6  »  сентября   2011 года  icon  автореферат разослан 15 сентября 2009 г. 
Декларации  принципов  толерантности  (1995  г.).  В  преамбуле  характеризуется 
  автореферат диссертации разослан  «  6  »  сентября   2011 года  icon  автореферат разослан «22»  сентября 2010 г. 
В  настоящее  время  одной  из  актуальных  проблем  современной  регенеративной 
  автореферат диссертации разослан  «  6  »  сентября   2011 года  icon  автореферат разослан «       » сентября 2007 г. 
Гоу впо «Российский государственный   профессионально-педагогический университет»  
  автореферат диссертации разослан  «  6  »  сентября   2011 года  icon  автореферат разослан       апреля 2008 года 

  автореферат диссертации разослан  «  6  »  сентября   2011 года  icon  автореферат разослан « 2 »  ноября  2010 года. 
На  1  января  2009  года  в  Италии  зарегистрировано  почти  4  млн.  279  тыс. 
  автореферат диссертации разослан  «  6  »  сентября   2011 года  icon  автореферат разослан « 13  » апреля 2007 года 
Ведущая организация: фгу  Всероссийский государственный центр                                            
  автореферат диссертации разослан  «  6  »  сентября   2011 года  iconАвтореферат диссертации на соискание ученой степени
Защита   диссертации   состоится   19   октября   2012   г.   в   11   часов   на   заседании 
Разместите кнопку на своём сайте:
kak.znate.ru


База данных защищена авторским правом ©kak.znate.ru 2012
обратиться к администрации
KakZnate
Главная страница