автореферат диссертации разослан  «  6  »  сентября   2011 года 




Скачать 167.54 Kb.
PDF просмотр
Название  автореферат диссертации разослан  «  6  »  сентября   2011 года 
страница11/11
Дата конвертации20.12.2012
Размер167.54 Kb.
ТипАвтореферат
1   2   3   4   5   6   7   8   9   10   11

что  их  взаимодействие  носит  сложный  характер  и,  по  всей  вероятности,  определяется 
соотношением  внутриклеточных  пулов  адениновых  и  гуаниновых  нуклеотидов.  В  наших 
опытах  при  устранении  PurR-регуляции  мы  наблюдали  примерно  17-кратное  усиление 
экспрессии  pur-оперона.  В  то  же  время,  удаление  терминатора  транскрипции  в  лидерной 
области  pur-оперона  приводило  к  9-кратному  увеличению  уровня  его  экспрессии,    что 
свидетельствует  о  важной  роли  пула  гуаниновых  производных  в  регуляции.  Однако 
удаление обоих регуляторных элементов вызывало ярко  выраженный синергидный эффект: 
экспрессия  оперона  возрастала  более  чем  в  200  раз.  Эти  данные  свидетельствуют,  с  одной 
стороны,  о  мощном  биосинтетическом  потенциале  pur-оперона,  а  с  другой  –  о  наличии  в 
клетках дикого типа строгого баланса между пулами нуклеотидов, обеспечивающего гибкую 
регуляции экспрессии  pur-оперона.   
 
Наконец,  сама  по  себе  структурная  организация  pur-оперона  также  требует 
специального  обсуждения.  Даже  при  беглом  анализе  структуры  этого  оперона  обращает  на 
себя  внимание  то  обстоятельство,  что  структурный  ген  purF,  ответственный  за  первую 
стадию  биосинтеза  пуринов  расположен  примерно  в  середине  оперона,  тогда  как  ген  purD
контролирующий  следующую  стадию  биосинтеза  занимает  самое  дистальное  положение. 
Более  того,  между  этими  генами  располагается  внутренний  Rho-независимый  терминатор 
транскрипции  (T  F-M),  присутствие  которого  должно  еще  больше  усиливать  дисбаланс  в 
уровне  синтеза  первого  и  второго  ферментов  биосинтеза  пуринов.  Действительно,  мы 
получили  экспериментальное  подтверждение,  что  удаление  этого  терминатора  приводит  к 
существенному усилению экспрессии дистального гена purD.  
Что  касается  изучения  роли  сенсорной  РНК  в  регуляции  гена  pbuE  B.  subtilis,  то 
проведенный  нами  мутационный  анализ  лидерной  области  этого  гена  подтверждает 
описанную  в  литературе  трехмерную  модель  структурно-функциональной  организации  А-
бокса.  Не  вызывает  сомнения,  что  связывание  пуриновых  оснований  с  сенсорной  РНК 
приводит  к  ее  конформационному  переходу  из  одного  альтернативного  состояния 
(терминатор)    в  другое  (антитерминатор).  Вместе  с  тем,  динамика  этого  перехода  и 
реализация  изменения  конформации  сенсорной  РНК  на  уровне  экспрессии  гена  pbuE 
остается  не  до  конца  понятной.  В  работе,  посвященной  изучению  кинетических 
характеристик  комплекса  РНК  А-бокса  с  аденином,  показано,  что  на  процесс  разрушения 
терминатора  и  формирования  антитерминирующей  структуры  под  действием  аденина 
влияют  такие  параметры,  как  концентрация  нуклеозидтрифосфатов,  скорость  элонгации 
РНК-полимеразы, наличие транскрипционных пауз в структуре А-бокса, а также, возможно, 
присутствие  белков,  модулирующих  процесс  элонгации  транскрипции.  Вероятно,  с  этой 
множественностью  регуляции  экспрессии  гена  pbuE  связаны  некоторые  различия 
20 
 

полученных  нами  результатов  с  опубликованными  данными.  Так,  например,  по 
литературным данным, константа связывания гуанина с РНК А-бокса почти на три порядка 
ниже,  чем  у  аденина  и,  в  соответствии  с  этим,  не  наблюдается  усиление  экспрессии  гена 
pbuE  in  vivo  в  присутствии  гуанина.  В  то  же  время,  в  наших  опытах  экзогенный  гуанин 
вызывал  достаточно  выраженное  (10-кратное)  усиление  экспрессии  конструкции  pbuE-lacZ
содержащей  А-бокс  дикого  типа  (рис.  11),  что,  впрочем,  согласуется  с  данными  других 
работ.  
 
Наконец,  на  последнем  этапе  работы  в  результате  проведенных  исследований  на 
основе бактерий B. subtilis получен штамм-продуцент AICAR – перспективного кандидата в 
лекарственные  препараты  широкого  терапевтического  применения.  Стратегия  получения 
штамма-продуцента  AICAR  основана  на  направленной  реконструкции  пуринового 
метаболизма B. subtilis. Следует отметить, что примерно такая же стратегия уже применялась 
для создания штаммов-продуцентов инозина на модели B. subtilis
На  первом  этапе  работы  в  геном  бактерий  была  внесена  инсерция  в  гене  purR
кодирующем  синтез  белка-репрессора  pur-оперона  и  получена  делеция  терминатора 
транскрипции в лидерной области pur-оперона, что обеспечило максимальную дерепрессию 
ферментов  биосинтеза  пуринов  de  novo.  По  имеющися  данным  в  литературе,  присутствие 
такого рода мутаций в геноме  B. subtilis обеспечивало накопление инозина в культуральной 
жидкости до 6 г/л. Затем в геноме бактерий была получена делеция гена purH, кодирующего 
синтез  фермента  AICAR  трансформилазы/IMP  циклогидролазы.  Инактивация  этого 
фермента  нарушает  реакцию  превращения  AICAR  в  IMP  и  приводила  к  его  накоплению  в 
клетке до 4-5 г/л, что примерно соответствует уровню накопления инозина, описываемому в 
литературе.  
На  следующем  этапе  работы  мы  применили  полностью  оригинальный  подход, 
основанный  на  введении  в  клетки  бацилл  модифицированных  гетерологичных  генов 
пуринового  биосинтеза  из  E.  coli.  При  этом  предварительно  был  проведен  сайт-
направленный мутагенез генов prs и purF E. coli, кодирующих ключевые ферменты синтеза 
предшественников  пуринов  с  целью  получения  их  мутантных  вариантов  со  снятым 
ретроингибированием пуриновыми нуклеотидами. Наконец, на последнем этапе работы была 
осуществлена интеграция модифицированных генов prs и purF E. coli в хромосому B. subtilis 
под  контролем  сильного  промотора,  обеспечивающего  высокий  уровень  их  экспрессии  в 
клетках  B.  subtilis.  В  итоге  работы  получен  штамм-продуцент,  накапливающий  11-13  г/л  
AICAR в КЖ. 
В заключение, следует отметить, что совсем недавно появилось сообщение о том, что 
AICAR 
успешно 
прошел 
вторую 
стадию 
клинических 
испытаний 
в 
качестве 
21 
 

противоракового препарата. Показан положительный эффект AICAR при лечении пациентов, 
страдающих  хронической  лимфоцитарной  лейкемией,  множественной  миеломой  и 
лимфомой  из  клеток  мантийной  зоны.  Сконструированный  в  настоящей  работе  штамм-
продуцент 
AICAR 
может 
послужить 
основой 
для 
разработки 
промышленного 
микробиологического производства этого соединения. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

22 
 

Выводы: 
 
1.  Выявлена роль двух Rho-независимых терминаторов транскрипции, один из которых 
расположен  в  лидерной  области,  а  второй  −  в  межгенном  участке    purF-purM,    в 
регуляции  экспрессии  pur-оперона.  Установлено,  что  максимальная  экспрессия  pur-
оперона  достигается  при  делетировании  обоих  терминаторов  транскрипции  и 
регуляторного гена purR
2.   Методом  сайт-направленного  мутагенеза  изучена  структурно-функциональная 
организация  лидерной  области  pur-оперона  B.  subtilis.  Установлено,  что  помимо 
негативного контроля с участием белка-репрессора PurR, регуляция экспрессии этого 
оперона  осуществляется  на  уровне  терминации  транскрипции  с  помощью  сенсорной 
РНК  в  результате  ее  связывания  со  специфическими  метаболитами-эффектороми  
гуанином и гипоксантином. 
3.  Проведен  мутационный  анализ  лидерной  области  гена  pbuE  B.  subtilis,  кодирующего 
синтез  трансмембранного  белка,  ответственного  за  экспорт  пуриновых  оснований  из 
клетки.    Установлено,  что  лидерная  область  гена  pbuE  кодирует  специфическую 
сенсорную  РНК.  Показано,  что  главными  низкомолекулярными  эффекторами  этой 
сенсорной РНК являются пуриновые основания аденин и диаминопурин, добавление 
которых в среду приводит к усилению экспрессии гена pbuE. 
4.   Показано,  что  присутствие  в  консервативной  области  лидерной  РНК  гена  pbuE  (А-
бокс)  двух  нуклеотидных  замен  70U→С  и  A100→G  приводит  к  изменению 
специфичности  сенсорной  РНК  in  vivo:  вместо  аденина  позитивным  эффектором 
транскрипции  становится  гуанин.  Подтверждена  трехмерная  модель  структурно-
функциональной организации А-бокса гена pbuE B. subtilis. 
5. Проведена реконструкция пуринового метаболизма у штамма B. subtilis, направленная 
на  сверхпродукцию  AICAR  клетками  бактерий.  Полученный  в  результате 
проведенных  генетических  манипуляций  штамм  B.  subtilis  накапливает  11-13  г/л 
AICAR в культуральной жидкости. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

23 
 

Список печатных работ, опубликованных по теме диссертации: 
 
1.  Лобанов  К.В.,  Королькова  Н.В.,  Еремина  С.Ю.  и  др.  Мутации,  приводящие  к 
изменению специфичности сенсорной РНК, кодируемой геном pbuE Bacillus subtilis. // 
Генетика. 2007. Т. 43. №6. C. 859-864. 
2.  Миронов  А.С.  и  Лобанов  К.В.  (2007)  Сенсорные  РНК  и  их  роль  в  регуляции 
экспрессии  генов.  В  кн.  Молекулярная  генетика,  биофизика  и  медицина  сегодня 
(Бреслеровские  чтения  II),  ред.  В.А.  Ланцов,  изд.  ПИЯФ  РАН (Гатчина.Санкт-
Петербург), стр.278-298. 
3.  Миронов  А.С.,    Прошкин  С.А.,  Лобанов  К.  В.,  Лосева  С.А.  «Регуляторные    РНК 
прокариот».  Материалы  пятого  съезда  Вавиловского  общества  генетиков  и 
селекционеров Москва, 21 – 27 июня 2009 г., С.34.  
4.  Лобанов  К.В.,  Королькова  Н.В.,  Еремина  С.Ю.  и  др.  Мутационный  анализ  лидерной 
области пуринового оперона Bacillus subtilis // Генетика. 2011. Т.47. №7. С. 890-899. 
5.  Лобанов  К.В.,  Эрраис  Лопес  Л.,  Королькова  Н.В.  и  др.  Реконструкция  пуринового 
метаболизма  у  Bacillus  subtilis  с  целью  получения  штамма-продуцента  AICAR  – 
нового  препарата  широкого  терапевтического  применения  //  Acta  Naturae.  2011.  Т.3.  
№ 2(9). С. 83-93.  
24 
 

1   2   3   4   5   6   7   8   9   10   11

Похожие:

  автореферат диссертации разослан  «  6  »  сентября   2011 года  icon  автореферат диссертации разослан «30» октября 2012 года. 
В. С. Елистратова,  С. И. Левиковой,  В. М. Мокиенко,  Т. Г. Никитиной  и  др.,  со
  автореферат диссертации разослан  «  6  »  сентября   2011 года  icon  автореферат разослан  «    » сентября 2010 года. 

  автореферат диссертации разослан  «  6  »  сентября   2011 года  iconАвтореферат разослан 30 сентября 2006 года. 
Терминология.  В  диссертационной  работе,  для  изложения  результатов  исследования 
  автореферат диссертации разослан  «  6  »  сентября   2011 года  icon  автореферат разослан 15 сентября 2009 г. 
Декларации  принципов  толерантности  (1995  г.).  В  преамбуле  характеризуется 
  автореферат диссертации разослан  «  6  »  сентября   2011 года  icon  автореферат разослан «22»  сентября 2010 г. 
В  настоящее  время  одной  из  актуальных  проблем  современной  регенеративной 
  автореферат диссертации разослан  «  6  »  сентября   2011 года  icon  автореферат разослан «       » сентября 2007 г. 
Гоу впо «Российский государственный   профессионально-педагогический университет»  
  автореферат диссертации разослан  «  6  »  сентября   2011 года  icon  автореферат разослан       апреля 2008 года 

  автореферат диссертации разослан  «  6  »  сентября   2011 года  icon  автореферат разослан « 2 »  ноября  2010 года. 
На  1  января  2009  года  в  Италии  зарегистрировано  почти  4  млн.  279  тыс. 
  автореферат диссертации разослан  «  6  »  сентября   2011 года  icon  автореферат разослан « 13  » апреля 2007 года 
Ведущая организация: фгу  Всероссийский государственный центр                                            
  автореферат диссертации разослан  «  6  »  сентября   2011 года  iconАвтореферат диссертации на соискание ученой степени
Защита   диссертации   состоится   19   октября   2012   г.   в   11   часов   на   заседании 
Разместите кнопку на своём сайте:
kak.znate.ru


База данных защищена авторским правом ©kak.znate.ru 2012
обратиться к администрации
KakZnate
Главная страница